Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Resumo

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Resumo

Com eficiência, precisão e facilidade excepcionais, o sistema CRISPR/Cas9 melhorou significativamente a edição do genoma em experimentos de cultura de células e animais de laboratório. Ao gerar modelos animais, a eletroporação de zigotos oferece maior eficiência, simplicidade, custo e rendimento como uma alternativa ao método padrão-ouro de microinjeção. A eletroporação também é mais suave, com maior viabilidade, e fornece de forma confiável as ribonucleoproteínas (RNPs) Cas9/RNA de guia única (sgRNA) nos zigotos de linhagens comuns de camundongos de laboratório (por exemplo, C57BL/6J e C57BL/6N) que se aproximam de 100% de eficiência de entrega. Esta técnica permite a inserção/deleção (indels) mutações, mutações pontuais, a deleção de genes inteiros ou éxons, e pequenas inserções na faixa de 100-200 pb para inserir LoxP ou tags curtas como FLAG, HA ou V5. Embora constantemente aprimorados, aqui apresentamos o estado atual do CRISPR-EZ em um protocolo que inclui a produção de sgRNA através da transcrição in vitro, processamento embrionário , montagem de RNP, eletroporação e genotipagem de embriões pré-implantação. Um pesquisador de nível de pós-graduação com experiência mínima na manipulação de embriões pode obter embriões geneticamente editados em menos de 1 semana usando este protocolo. Aqui, oferecemos um método simples, de baixo custo, eficiente e de alta capacidade que pode ser usado com embriões de camundongos.

Introdução

A edição do genoma em camundongos vivos foi consideravelmente simplificada e tornou-se acessível e mais acessível desde o surgimento da edição CRISPR ^1,2,3. Tentativas iniciais de edição animal utilizaram microinjeção para entregar mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear ^4,5,6. Embora a microinjeção seja bastante eficaz, a quantidade de prática necessária para dominá-la totalmente pode não ser apropriada para estagiários e estudantes e também requer equipamentos caro....

Protocolo

Todos os cuidados e uso de animais ao longo deste protocolo aderiram às políticas da Lei de Bem-Estar Animal do Guia ILAR para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e seguiram as diretrizes e políticas da AVMA para eutanásia e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia (IACUC). O protocolo de cuidado e uso de animais foi revisado e aprovado pela IACUC da Universidade da Pensilvânia para este projeto. Por uma questão de conformidade e cautela, por favor, procure todas as autorizações necessárias antes de tentar este protocolo.

1. sgRNA e oligo design opcional do doador

1. Pro....

Resultados

Este método gera mais de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentração de 6.000 ng/L) para uma montagem eficiente do RNP Cas9/sgRNA. O método de superovulação de rotina descrito aqui normalmente produz 10-20 embriões viáveis por fêmea entupida. Devido a erros de manuseio e perdas típicas associadas à manipulação embrionária, espera-se que 80% dos embriões sejam fertilizados, viáveis e em excelente condição após a eletroporação. Para ajudar os pesquisadores a executar um experimento bem-sucedido, fornecemos um exemplo de estr.......

Discussão

Apresentamos aqui uma tecnologia de edição de genoma de camundongo direta e altamente eficiente. A eletroporação pode ser usada para gerar embriões modificados em 1-2 semanas (Figura 1) e pode produzir camundongos editados dentro de 6 semanas⁹. Em comparação com protocolos baseados em eletroporação desenvolvidos contemporaneamente que fornecem RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32, o método descrito aqui é conceitualmente semelhante e oferece eficiênc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cubeta de eletroporação com intervalo de 0,1 cm	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, agulha de 1/2 polegada	BD	cat. no. 305111	Superovulação
3– Camundongos machos de 8 meses e camundongos fêmeas de 3 a 5 semanas	JAX	cat. no. 000664	Superovulação
35 mm Placa de cultura de tecidos	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Cultura de embriões
60 mm Placa de cultura de tecidos	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Processamento de embriões
6x corante de carregamento	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Síntese e genotipagem
Solução ácida de Tyrode (AT), grau de cultura de embriões	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Processamento de embriões
BSA, grau de cultura de embriões	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Processamento e cultura de embriões
Cas9 proteína	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	Síntese de sgRNA
DPBS (livre de cálcio e magnésio)	Gibco	cat. no. 14190-144	Processamento de embriões
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotipagem
EDTA, anidro	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Etanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA
Synthesis Gelatina (pó) tipo B, grau laboratorial	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis
Buffer Glycerol,  grau de biologia molecular	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polimerase	Promega	cat. no. M712	Genotipagem
HEPES, grau de cultura de células	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10.000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotipagem
HiScribe T7 Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Gonadotrofina corion humana, liofilizada  (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulação
Hialuronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Processamento de Embriões
KSOMaa Evolve meio (meio simplex otimizado com potássio mais aminoácidos)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Cultura de embriões
LE agarose, grau analítico	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Síntese e genotipagem
M2 meio	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Processamento de embriões
Cloreto de magnésio, anidro (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP e tampão de lise
óleo mineral	Millipore	cat. no. ES-005C	Cultura de Embriões
Nonidet P-40, substituto (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Tampão de lise
Água livre de nuclease, grau de biologia molecular	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Síntese e Genotipagem
Oligos para síntese de sgRNA, oligo de doador e primers de PCR para genotipagem	Tecnologias de DNA	integradas pedidos personalizados	de sgRNA Design
Meio de soro reduzido	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Cultura de embriões
DNA polimerase de alta fidelidade	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Cloreto de potássio grau de biologia molecular (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP e tampão de lise
Égua grávida gonadotrofina sérica liofilizida ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulação
Proteinase K, grau de biologia molecular	Fisher	cat. no. BP1700-100	Tampão de lise
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sem RNase	VWR	cat. n.º 20170-333	Síntese e genotipagem de sgRNA
Tubos de tiras PCR de oito poços sem RNase	VWR	cat. n.º 82006-606	sgRNA Síntese e genotipagem
Grânulos de purificação magnética	GE Healthcare	cat. n.º 65152105050250	sgRNA Síntese
Tris (2-carboxietil) fosfina cloridrato (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solução, pH 8,5 grau de biologia molecular	Teknova	cat. no. T1085	Tampão de lise
Tween 20 grau de biologia molecular	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Tampão de lise