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Artigo de método

Implantes de Cabeça para Neuroimagem de Ratos Acordados e Fixados na Cabeça

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DOI:

10.3791/64324

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7 de setembro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

Neste artigo

Resumo

Um novo procedimento detalhado para imagens funcionais de ratos acordados com a cabeça fixada é descrito.

Resumo

Os anestésicos, comumente usados em pesquisas pré-clínicas e científicas fundamentais, têm uma influência depressiva nas funções metabólicas, neuronais e vasculares do cérebro e podem influenciar negativamente os resultados neurofisiológicos. O uso de animais acordados para estudos de pesquisa é vantajoso, mas representa o grande desafio de manter os animais calmos e estacionários para minimizar artefatos de movimento ao longo da aquisição de dados. Imagens acordadas em roedores de tamanho menor (por exemplo, camundongos) são muito comuns, mas permanecem escassas em ratos, pois os ratos são maiores, mais fortes e têm uma maior tendência a se opor às restrições de movimento e fixação da cabeça durante as longas durações necessárias para a aquisição de imagens. Um novo modelo de neuroimagem de ratos acordados e fixados na cabeça usando tipoias personalizadas costuradas à mão, implantes de cabeça impressos em 3D, toucas de cabeça e uma estrutura de cabeça é descrito. Os resultados obtidos após uma única tentativa de estimulação com bigode único sugerem um aumento na intensidade da resposta funcional evocada. A aquisição da resposta funcional evocada de ratos acordados com a cabeça fixada é mais rápida do que a de ratos anestesiados, confiável, reprodutível e pode ser usada para estudos longitudinais repetidos.

Introdução

A maioria das investigações básicas, pré-clínicas e translacionais de neuroimagem científica é adquirida de animais anestesiados 1,2. Os anestésicos facilitam a experimentação, mas influenciam continuamente o metabolismo do cérebro e do corpo, a pressão arterial e a frequência cardíaca3. O tipo de anestésico, a duração e a via de administração adicionam variáveis de confusão à interpretação dos dados que podem contribuir para a reprodutibilidade e falhas translacionais4. Um grande gargalo dos estudos de neuroimagem em ratos acordados e fixados na cabeça é a necessidade de manter o rato estacionário e calmo durante todo o processo de preparação e aquisição de dados. Pequenos movimentos produzem artefatos de movimento injustificados, o que pode afetar negativamente a análise e a interpretação dos dados.

Um novo modelo de neuroimagem de ratos acordados e fixados na cabeça usando tipoias personalizadas, implantes de cabeça impressos em tridimensional (3D), toucas de cabeça e uma estrutura de cabeça foi desenvolvido que oferece várias vantagens para fácil experimentação. O implante de cabeça 3D é leve e cobre uma pequena porção do crânio necessária para a transfixação. Os implantes e tampas de cabeça impressos em 3D são projetados usando software CAD (computer-aided design). Os protocolos de estimulação com whisker, aquisição de dados, análise de dados e resultados de ratos anestesiados foram descritos em detalhes em trabalhos anteriores 5,6,7.

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Protocolo

Todos os procedimentos estavam em conformidade com as diretrizes do National Institute of Health e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Irvine. Sete ratos machos e uma fêmea (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g) foram utilizados neste estudo. Após a conclusão do estudo, os ratos foram sacrificados usando overdose de dióxido de carbono.

1. Projeto de diferentes componentes

  1. Projeto do implante de cabeça:
    1. Realizar o implante cefálico utilizando software CAD (Figura 1C) e projetá-lo para obter imagens da área posterior ao bregma e adjacente à linha média, centrada no córtex somatossensorial. Certifique-se de que o implante de cabeça cubra uma área de 0,9 mm a 1,9 mm no crânio longe da área de imagem.
    2. Use apenas três parafusos para ancorar o implante de cabeça no crânio do rato. Projete todos os orifícios do parafuso de modo que permaneçam no lado oposto da linha média no hemisfério contralateral do hemisfério imageado.
    3. Coloque uma barra, vazada por dentro, na parte superior do implante de cabeça para permitir que os fios fixem a tampa da cabeça ao implante de cabeça, como mostra a Figura 1D.
  2. Design da touca da cabeça:
    1. Certifique-se de que a calota cubra completamente a área de imagem e a proteja de qualquer tipo de trauma, como mostrado na Figura 1A, B. Adicione uma curvatura à touca para que ela se alinhe ao formato da cabeça sem causar dificuldade às atividades diárias do animal nas gaiolas enriquecidas padrão.
    2. Corte a parte interna da tampa da cabeça em uma forma retangular mais larga para que a parte superior do implante de cabeça possa se encaixar nela, como mostrado na Figura 1E. Perpendicularmente a esse retângulo, corte duas outras regiões retangulares para ancorar a calota craniana ao implante cefálico.
    3. Passar um fio através da barra oca superior do implante de cabeça para fixação da touca na cabeça do rato como mostrado na Figura 1E-G. Passe o segundo fio da mesma forma.
      OBS: Estes fios podem ser facilmente removidos utilizando alicates ou pinças. Os arquivos de impressão 3D são fornecidos (formato de arquivo: STL) como Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2.
  3. Projeto da estrutura da cabeça:
    1. Projete a estrutura da cabeça de forma que uma parte cortada possa se mover através da barra superior do implante de cabeça e seja fixada usando uma braçadeira.
    2. Incline a outra parte do corte para fornecer força extra para manter a cabeça do rato fixa para tornar o lado contralateral completamente acessível para aquisição de imagens. Para fins deste estudo, corte a chapa de aço com snips de estanho para produzir a armação da cabeça (Figura 1H, I).
      NOTA: Esta parte também pode ser impressa em 3D.

2. Treinamento inicial de ratos

  1. Permitir que os ratos se aclimatem ao ambiente do biotério em suas gaiolas por 2-3 dias.
  2. Comece a manusear o rato em uma sala tranquila. Abra a gaiola e peça ao experimentador que coloque a mão dentro da gaiola perto do rato por 15-20 minutos para deixar o rato se habituar.
  3. Uma vez que o rato mostre calma por não se assustar ou fugir das mãos do experimentador, pegue suavemente o rato para manuseio. Manuseie o rato por 30-45 min todos os dias antes do treino de tipoia.

3. Treinamento de Sling

  1. Treine os ratos por pelo menos 2-3 dias nas tipoias antes da implantação cirúrgica do implante de cabeça e da touca de cabeça.
  2. Organize a configuração da tipoia conforme mostrado na Figura 2A. Limpe a configuração da tipoia usando lenços umedecidos a etanol.
    NOTA: Todas as tipoias são costuradas à mão e feitas de um material de rede na parte inferior ou em ambos os lados, como mostrado na Figura 2A, B.
  3. Para o treinamento da tipoia, anestesiar os ratos utilizando isoflurano a 4% para indução e 1% para manutenção até que não haja reflexo de pinça da pata traseira.
  4. Sob anestesia com isoflurano, colocar os ratos sobre uma folha plástica flexível medindo 20 cm x 8 cm (comprimento x largura), onde 10 cm x 8 cm da folha plástica é totalmente coberta com a parte mais macia da Velcro.
    NOTA: Anestesiar os ratos para treinamento de tipoia é uma etapa opcional, usada principalmente para reduzir o estresse e a ansiedade.
  5. Nos primeiros 2 dias do treinamento, coloque o rato aconchegante em uma meia de bebê (tamanho 0-3 meses) com a cabeça para fora através de um pequeno orifício incisado no final da meia.
  6. Enrole um pequeno pedaço de absorvente ao redor da parte inferior do corpo para manter o rato seco e coletar excrementos.
  7. Embrulhe o rato em um pano de algodão respirável (tamanho: 25 cm x 25 cm). Coloque o rato em uma folha de plástico que tenha Velcro tiras coladas nele.
  8. Fixe ainda mais o rato à folha de plástico usando tiras de Velcro de 0,5 cm de largura a uma distância de 3-6 mm uma da outra.
  9. Segure o rato na tipoia. Remova a anestesia gasosa. Permita que o rato se recupere da anestesia com gás na tipoia.
  10. Quando o rato começar a bater, ofereça algumas gotas de solução de sacarose a 10% como recompensa a cada 10-15 min.
  11. Apresente aleatoriamente ao rato os estímulos sensoriais que serão utilizados durante a aquisição de imagens (aqui estimulação com bigode, a cada 15-25 min) para acostumá-lo aos estímulos sensoriais. Estimule manualmente os bigodes em intervalos aleatórios.
  12. Treine o rato na tipoia por 1 h no dia 1, 2 h no dia 2 e 3 h no dia 3, como mostrado na Figura 2C.

4. Preparo pré-cirúrgico

  1. Imprima o implante de cabeça e a tampa da cabeça usando a impressora 3D (Figura 1).
  2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e cabeçotes (implantes e tampas) imergindo o equipamento no germicida Metricide28 por 10 horas. Enxágue bem as ferramentas com água estéril pouco antes da cirurgia.
  3. Expor o rato a 4% de isoflurano e, em seguida, manter a 1%-2% de isoflurano até que não haja reflexo de pinça da pata traseira. Essa cirurgia pode ser realizada sob vários tipos de anestesia, como isoflurano, pentobarbital sódico e quetamina-xilazina.
  4. Injetar atropina (0,05 mg/kg) por via intramuscular para reduzir as secreções mucosas para ajudar na respiração.
  5. Faça a barba da cabeça do rato 5 mm centrada em torno da linha média usando um aparador de cabelo começando entre os olhos até a parte de trás das orelhas.
  6. Monitore a saturação parcial de oxigênio e a frequência cardíaca através de um oxímetro de pulso e sonda do monitor de frequência cardíaca fixada na pata traseira do rato.
  7. Limpe a cabeça do rato e a área circundante três vezes com rodadas alternadas de betadina e lenços com álcool a 70%.
  8. Fixe o rato em um sistema estereotáxico.
  9. Inserir uma sonda retal lubrificada com vaselina para medir a temperatura corporal do rato e mantê-la através do sistema de feedback da manta de aquecimento para evitar hipotermia após a administração do anestésico.
  10. Administrar anestésico local cloridrato de lidocaína na concentração de 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 de peso corporal por via subcutânea no sítio cirúrgico.
  11. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
  12. Administrar anestésico local a 2% por via subcutânea sobre o sítio cirúrgico.
  13. Injetar 3 mL de solução de ringer com lactato à temperatura ambiente por via subcutânea para evitar a desidratação e fornecer nutrição durante a cirurgia.

5. Cirurgia

  1. Remova a parte da pele sobre o sítio cirúrgico (4 mm de diâmetro centrado em torno da linha média e centro da cabeça) usando tesoura cirúrgica afiada. Dissecar e remover parte da pele (~2 mm de diâmetro, sobre o córtex somatossensorial esquerdo) entre a orelha e o olho na parte temporal da cabeça.
  2. Remover, usando um bisturi, o tecido subjacente da pele (pericrânio) para expor o crânio. Limpe o crânio com gaze de algodão esterilizada.
  3. Retrair/ressecção do músculo temporal para expor o tamanho desejado para a área de imagem [7,5 mm por 7,5 mm para este estudo].
  4. Expor o crânio no hemisfério contralateral para o implante de cabeça. Coloque o implante de cabeça no crânio para verificar a localização dos parafusos de ancoragem para o implante, como mostra a Figura 2D-F.
  5. Marque o crânio para furar os parafusos usando tinta indiana com broca 1. Faça os furos da broca para os parafusos usando broca dental broca 3. Rosqueie o implante de cabeça no lugar.
  6. Secar o crânio com gaze estéril. Aplique uma fina camada de adesivo de tecido ao redor e abaixo do implante de cabeça para colá-lo ao crânio. Aplique uma camada de cimento dental para apoiar ainda mais o implante da cabeça no lugar e deixe o cimento secar por 2-3 min.
    OBS: O uso de adesivo tecidual em adição ao cimento dental garante uma forte fixação8.
  7. Usando broca odontológica broca 3, fina uma área de 7,5 mm x 7,5 mm no lado esquerdo do crânio logo posterior ao bregma e lateral à linha média. Afinar o crânio até ~50 μm como mostrado na Figura 3A.
  8. Aplique pomada antibiótica tópica sobre o local cirúrgico e, em seguida, cubra-o com uma fina camada de borracha de silicone para proteger o crânio afinado, como mostrado na Figura 3B. Cobrir o sítio cirúrgico com a touca cefálica, conforme demonstrado na Figura 3C. Fixe-o no lugar com os dois pequenos pedaços de fios que atravessam o implante da cabeça e a tampa da cabeça, como mostrado na Figura 3D, E. Aplique borracha de silicone para cobrir a cabeça e o crânio para estabilizar a cabeça ainda mais na cabeça do rato, como mostrado na Figura 3F.
    NOTA: A borracha de silicone fornece proteção adicional ao crânio afinado.
  9. Injetar flunixina meglumina (2,5 mg/kg) no rato por via subcutânea para controlar a dor e a inflamação. Para prevenir a infecção, injetar o antibiótico Enrosite enrofloxacina (22,7mg/ml, 10mg/kg +/-.01), por via intraperitoneal.
  10. Mova o rato para a câmara de recuperação para ajudar a manter sua temperatura corporal com uma manta de aquecimento e uma lâmpada de calor. Monitorar o rato continuamente até que ele recupere a consciência e possa manter a decúbito esternal.
  11. Devolva o rato à sua gaiola separada assim que se recuperar totalmente.
  12. Nos próximos 3 dias, administrar flunixina e buprenorfina para aliviar a inflamação e dor e enrosita para prevenir a infecção duas vezes ao dia.

6. Imagem acordada

  1. Anestesiar o rato com isoflurano a 4% para indução e 1% para manutenção quando não houver reflexo de pinça da pata traseira. Injetar acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) por via subcutânea.
    NOTA: Esta concentração de acepromazina está abaixo dos níveis de sedação suaves e só ajuda a manter os ratos calmos durante todo o processo de imagem.
  2. Usando tiras de Velcro personalizadas, fixe o rato na folha plástica usada durante os procedimentos de treinamento. Envolva a parte inferior do corpo usando uma almofada de absorção e coloque o rato confortavelmente na tipoia.
  3. Remova a borracha de silicone. Remova a tampa da cabeça removendo os fios de fixação. Fixe a estrutura da cabeça no implante de cabeça como mostrado na Figura 2G.
  4. Trave a moldura da cabeça em grampos como mostrado na Figura 2H, I.
  5. Remova a anestesia com gás. Lave a área de imagem com soro fisiológico 3x e limpe com gaze molhada. Seque a área de imagem e faça um poço, usando vaselina, ao redor da área de imagem. Preencher o poço com soro fisiológico esterilizado e cobrir com uma lâmina de vidro (Figura 2E).
  6. Referem-se aos procedimentos de aquisição de imagem óptica de sinal intrínseco, ao protocolo de estimulação com whisker, análise e apresentação dos dados, que foram discutidos em detalhes anteriormente 6,7.
  7. Durante todo o experimento, monitore os ratos em busca de sinais de agitação e inquietação, que podem ser ainda mais reduzidos cobrindo os olhos dos ratos com um pano macio ou gaze (opcional).

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Resultados

Os sinais representativos de imagem óptica de um único ensaio de um rato anestesiado e a resposta somada (de 40 tentativas coletadas) de um rato acordado são mostrados (Figura 4). A intensidade de sinal para estimulação com um único bigode de um rato acordado pode ser visualizada em um limiar mais alto do que para o rato anestesiado, mostrando um sinal mais forte do animal acordado. Os bigodes C2 de ratos são estimulados a 5 Hz por 1 s, e a resposta funcional é apresentada como uma mudança f...

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Discussão

O uso de imagens de ratos acordados e com a cabeça fixa oferece muitas vantagens em termos de facilidade e personalização. As tipoias personalizadas permitem que os ratos sejam envolvidos através de material de rede respirável, eliminando a necessidade de envolver os animais em câmaras de retenção plásticas fechadas por longos períodos de tempo10,11. Os ratos são mantidos calmos e livres de estresse durante as longas durações de sucessivas sessões de imagem usand...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha e Amirsoheil Zareh por sua ajuda durante o treinamento dos ratos e preparação dos slings. O financiamento foi fornecido pelo National Institutes of Health (NIH, Grant Number: NS119852) e Leducq Foundation (Grant Number:15CVD02).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RatosCharles RiverSprague Dawley
IsofluranoPivetal21295098Anestésico geral
Lidocaína HCl 2% injeçãoPhoenixL-2000-04Anestésico local
Injeção de sulfato de atropinaVedco5098907512Ajuda na respiração
Solução injetável de LactatoRinger Vedco
Injeção de flunixinaVedco6064408670Controle da dor
Injeção de enroseta (Enrofloxacina 2,27%)VetOne501084Evitar infecção
Injeção de PromAce (maleato de acepromazina)Beohringer Ingelheim136059
Pomada AnimaxDechra Produtos Veterinários122-75ingredientes ativos de nistatina 1000 unidades por grama, sulfato de neomicina 2,5 mg por grama, tiostreptônio 2500 unidades por grama e acetonido de triancinolona 1 mg por grama
Pomada oftálmica PuralubeDechra Veterinary Products211-38
Almofadas de preparação de PVP com iodo-povidonaMedlineMDS093917Betadine genérico
Cotonetes de álcool isopropílicoTecido BD326895
Vetbond adesivo3M1469SB
Broca (broca), carboneto cirúrgico padrãoSS Branco Burs14829#3 bur
Parafusos, 00-90 x 1/8 cabeça chata aço inoxidávelJ.I. MorrisF0090CE125Parafusos de ancoragem
Sistema estereotáxicoKopf Instruments1430
Manta de aquecimento homeotérmicaHarvard Apparatus50-7220-F
Oxímetro de pulso e monitor de frequência cardíacaKent ScientificMouseStat Jr.
VaselinaFisher ScientificP66-1LBPetrolatum
Fio genérico, cobre nuFisher Scientific15-545-2C20
gauge Teets Cold Cure powderPearson DentalC73-0054 ingrediente ativo: Metacrilato de metila
Teets Cold Cure líquidoPearson DentalC73-0078 ingrediente ativo: Metacrilato de metila
Borracha para molde de siliconeSmooth-OnBody Double Fastpolímero de silício
Metricide 28 (Germicida)MetrexOct-05
Tinta da Índia, pretoPelikan301051
Broca dentáriaNSK DentalUltimate XL-F
Impressora 3DPrusa Researchi3 MK3S+
Costurar fixadoresVelcro90030
Tela utilitária de triagem para animais de estimaçãoJoann10173334Material de rede
Broca (broca), carboneto cirúrgico padrãoSS White Burs14829#1 bur
50989088317

Referências

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