Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.
Artigo de método
Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.
Recentemente, biópsias líquidas têm sido usadas para diagnosticar várias doenças, incluindo câncer. Os fluidos corporais contêm muitas substâncias, incluindo células, proteínas e ácidos nucleicos originários de tecidos normais, mas algumas dessas substâncias também se originam da área doente. A investigação e análise dessas substâncias nos fluidos corporais desempenham um papel fundamental no diagnóstico de várias doenças. Portanto, é importante separar com precisão as substâncias necessárias, e várias técnicas são desenvolvidas para serem usadas para esse fim.
Desenvolvemos um tipo de dispositivo e plataforma lab-on-a-disc chamado CD-PRIME. Este dispositivo é automatizado e tem bons resultados para contaminação da amostra e estabilidade da amostra. Além disso, tem vantagens de um bom rendimento de aquisição, um curto tempo de operação e alta reprodutibilidade. Além disso, dependendo do tipo de disco a ser montado, plasma contendo DNA livre de células, células tumorais circulantes, células mononucleares do sangue periférico ou casacos bufantes podem ser separados. Assim, a aquisição de uma variedade de materiais presentes nos fluidos corporais pode ser feita para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo o estudo da ômica.
A detecção precoce e precisa de várias doenças, incluindo o câncer, é o fator mais importante para o estabelecimento de uma estratégia de tratamento 1,2,3,4. Em particular, a detecção precoce do câncer está intimamente relacionada ao aumento das chances de sobrevida do paciente 5,6,7,8. Recentemente, biópsias líquidas têm estado no centro das atenções para a detecção precoce do câncer. Os tumores sólidos sofrem ang....
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Todas as amostras de sangue total foram obtidas de pacientes com câncer de pulmão. A pesquisa e a análise na Clinomics são realizadas pelo Cancer Genomics Research Institute, e a aprovação da pesquisa do IRB pelo governo é liderada pelo Comitê de Revisão Institucional do Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) com o número do IRB registrado para pesquisa na Clinomics.
1. Preparação da amostra
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O objetivo desta técnica é isolar de forma fácil e automática substâncias associadas ao câncer do sangue total. Em particular, qualquer um pode usar esta técnica em todos os campos adequados de pesquisa e análise. A separação simultânea e reprodutível de múltiplas substâncias em uma única amostra de sangue é significativa em biópsias líquidas. Os discos LBx-1 e LBx-2 são usados para isolar plasma e buffy coat ou PBMC do sangue total. A Figura 1 mostra os materiais separados pela aplicação de.......
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A quantidade e a concentração de cfDNA e CTC dependem do indivíduo, estágio e tipo de câncer. Depende também da condição do paciente 2,4,5,10,20. Em particular, nos estágios iniciais ou pré-cancerosos do câncer, as concentrações de substâncias relacionadas ao câncer são muito baixas, por isso há uma grande possibilidade de que não possa ser detectado. No entan.......
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Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.
Este manuscrito foi apoiado em parte pelo Fundo de Desenvolvimento de Dispositivos Médicos da Coreia (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e pelo Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1% BSA (Albumina de Soro Bovino) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Tubo de Microcentrífuga de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | |
| Tubo Cônico de 15 mL | SPL | 50015 | |
| 4150 Sistema TapeStation | Agilent | G2992AA | Fita de Tela de DNA Livre de Células (Agilent, 5067-5630), Tampão de Amostra de DNA Livre de Células (Agilent, 5067-5633) |
| Kit de Isolamento de DNA Livre de Células de Alta Eficiência MiniMax Apostle | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 versões preparatórias |
| BD Tubos de coleta de sangue Vacutainer | Tubo | 367525 | EDTA (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Equipamento de personalização baseado em microscópio Allegro Plus | |
| CD45 Anticorpo monoclonal (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Cartucho automático | Clinomics | CLX-M3001 | |
| Cartucho LBx-1 | Clinomics | CLX-M4101 | |
| Cartucho LBx-2 | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrumento | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Tampa de Vidro | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Suporte de Ímã | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | solução de gradiente de densidade |
| Ponta de Filtro, 10 µ L | Axygen | AX-TF-10 | As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada. |
| Ponta do Filtro, 200 µ L | Axygen | AX-TF-200 | As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada. |
| Ponta do Filtro, 100 µ L | Axygen | AX-TF-100 | As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada. |
| Ponta de Filtro, 1000 µ L | Axygen | AX-TF-1000 | As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada. |
| Anticorpo anti-CD326 (EpCAM) FITC | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Citoqueratina Humana | BD Biosciences | 347653 | |
| Solução de formaldeído (35% em peso em H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Luva de látex | Microflex | 63-754 | |
| Rack de separação de esferas magnéticas | V & P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Pipetagem Manual (0,5-10 µ L) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Pipetagem Manual (2-20 µ L) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Pipetagem Manual (10-100 µ L) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Pipetagem Manual (20-200 µ L) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Pipetagem Manual (100-1000 µ L) | Eppendorf | 3120000062 | |
| com DAPI - Aquoso, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Controle de IgG Humana Normal | R& D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Solução salina tamponada com fosfato) | Corning | 21-040CVC | |
| Auxiliar de pipeta portátil | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| Caixa de coloração StainTray | Pipeta | M920 | |
| (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton Solução X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sangue | Armazenado a 4-8 ° C coletando em tubo estável de EDTA ou cfDNA : Se o sangue total for insuficiente em 9 mL, adicione PBS (solução salina tamponada com fosfato) o quanto for necessário. | ||
| X-Cite 120Q (Iluminador de Lâmpada de Fluorescência) | Excelitas | 010-00157 |
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