Artigo de método

Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (Oryzias latipes)

DOI:

10.3791/64326

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6 de outubro de 2022

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1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve dois métodos rápidos e eficientes para a coleta de espermatozoides do pequeno modelo de medaka de peixe (Oryzias latipes), bem como um protocolo para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma usando a análise de espermatozoides assistida por computador (CASA).

Resumo

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A medaka japonesa (Oryzias latipes) é um peixe teleósteo e um modelo emergente de vertebrados para pesquisa em ecotoxicologia, desenvolvimento, genética e fisiologia. Medaka também é usado extensivamente para investigar a reprodução de vertebrados, que é uma função biológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A qualidade do esperma é um importante indicador da fertilidade masculina e, portanto, do sucesso da reprodução. Técnicas para extração de espermatozoides e análise de espermatozoides estão bem documentadas para muitas espécies, incluindo peixes teleósteos. A coleta de espermatozoides é relativamente simples em peixes maiores, mas pode ser mais complicada em peixes modelo pequeno, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe, o medaka japonês: dissecção dos testículos e massagem abdominal. Este artigo demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Este artigo também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para avaliar objetivamente vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, duração da motilidade, concentração relativa). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Introdução

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Medaka japonês é um pequeno peixe teleósteo de água doce que põe ovos nativo do leste da Ásia. Medaka tornou-se um excelente sistema modelo de vertebrados para estudos de ecotoxicologia, genética do desenvolvimento, genômica e biologia evolutiva e fisiologia 1,2. Semelhante ao popular peixe-zebra, eles são relativamente fáceis de reproduzir e altamente resistentes a muitas doenças comuns de peixes 1,2. Existem várias vantagens em usar a medaka como modelo, incluindo um curto tempo de geração, embriões transparentes 1,2

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Protocolo

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Toda a experimentação e manuseio de animais foram conduzidos de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental da Universidade Norueguesa de Ciências da Vida (NMBU). Os experimentos foram realizados com medaka japonesa macho adulto (6-9 meses de idade) (cepa Hd-rR) criado no NMBU (Ås, Noruega). Os métodos também foram brevemente testados em medaka japonesa macho de 9 meses de idade (cepa CAB) criada no Instituto Nacional de Pesquisa para Agricultura, Alimentação e Meio Ambiente (INRAE, Rennes, França).

1. Preparação do instrumento e da solução

  1. Preparar solução anestésica (tricaína a 0,6%).

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    Resultados

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    Tipo de dados obtidos
    A análise da motilidade espermática do software SCA Evolution fornece dados sobre motilidade (porcentagem de espermatozoides móveis e imóveis), bem como progressividade (porcentagem de espermatozoides progressivos e não progressivos) e velocidade (porcentagem de espermatozoides rápidos, médios e lentos). Também combina progressividade e velocidade (progressiva rápida, progressiva média, não progressiva). Esses rótulos são baseados em medidas (Figura 3A

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    Discussão

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    A osmolalidade é um fator importante na ativação do espermatozoide de peixes36,37. Geralmente, os espermatozoides são imóveis nos testículos e tornam-se móveis em meios hiperosmóticos em relação ao líquido seminal para peixes marinhos e hipo-osmóticos em relação ao líquido seminal para peixes de água doce37. Semelhante ao sangue, o plasma seminal em peixes de água doce é tipicamente menor do que o de peixes marinhos (cerca de 300 mOsmol/kg.......

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    Divulgações

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    Os autores não têm nada a revelar.

    Agradecimentos

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    Este trabalho foi financiado pela Universidade Norueguesa de Ciências da Vida e pelo programa Fulbright dos EUA. Os autores gostariam de agradecer a Anthony Peltier e Lourdes Carreon G Tan da NMBU pela manutenção das instalações de pesca e a Guillaume Gourmelin do ISC LPGP da INRAE (França) por fornecer espaço de peixe e laboratório para testar ainda mais esses métodos.

    ....

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Tubos de 1,5 mLAxygenMCT-150-CQualquer marca padrão pode ser usada
    10 µ L micropipeta de vidro calibrado descartável e conjunto de tubo aspiradorDrummond2-000-010
    Objetiva de 10x com contraste de faseNikonMRP90100
    Tubos de 2 mLAxygenMCT-200-c-sQualquer marca padrão pode ser usada
    Pinça BluntFerramentas de Belas Ciências11000-12
    Pinça lisa sem corteMilliporeXX6200006P
    Lâmina de contagem descartável de 20 mícronsMicroptic20.2.25 Leja 2 corrediças de câmara
    Microscópio de dissecaçãoOlympusSZX7Qualquer marca padrão pode ser usada
    Pinça finaFerramentas de ciências finas11253-20
    HBSSSigmaaldrichH8264-1L
    Esponja de retençãoauto-fabricada
    Microscópio invertidoNikonEclipse Ts2R
    SCA EvolutionMicroptic
    Tesoura de dissecação pequenaFine Science Tools14090-09
    Cloreto de sódio (NaCl)SigmaaldrichS9888
    Vórtice de mesaLabnetC1301B
    TricaineSigmaaldrichA5040

    Referências

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    1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
    2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).....

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    Reimpressões e permissões

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    Etiquetas

    Sperm CollectionComputer Assisted Sperm AnalysisJapanese MedakaTeleost FishAbdominal MassageTestes DissectionSperm MotilitySperm QualityFertility AssessmentEcotoxicology Model

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