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Artigo de método

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

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DOI:

10.3791/64332

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20 de outubro de 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Neste artigo

Resumo

A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.

Resumo

A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.

Introdução

A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica 1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S3581. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular 2,6.

ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose 9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida porZBP11 11. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.

A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular24 e espectrometria de massas25.

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada porZBP1 13,14,15. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração26, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.

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Protocolo

1. Preparação de tiramida biotinilada

  1. Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.

2. Manutenção das células HT-29 em cultura

NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor27 que codifica ZBP1 humano.

  1. Manter as células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy suplementadas com L-glutamina, sódio-piruvato e 10% de soro fetal bovino (a partir de agora referido como meio completo) e manter em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Idealmente, use células de um número de passagem baixo (menos de 10). Deixe as células se recuperarem por pelo menos 5 dias após o ciclo de descongelamento antes do início do experimento.
  2. Para separar as células do balão de cultura, retirar o meio e lavar as células com 5 ml de PBS (pré-aquecido a 37 °C). Em seguida, adicionar a quantidade adequada de tripsina/EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,032%, respetivamente, pré-aquecida a 37 °C) às células (2 ml para um balão T75, 3 ml para um balão T175).
  3. Incubar as células com tripsina/EDTA até 10 min numa incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Seguidamente, toque no balão e verifique visualmente se as células se desprenderam do balão utilizando um microscópio com uma ampliação objetiva de 4x-20x.
  4. Se as células não estiverem totalmente separadas, incubar durante mais 5 minutos a 37 °C. Quando as células estiverem descoladas, interromper a reacção enzimática adicionando 6 ml de meio completo ao balão.
  5. Reúna a suspensão celular em um tubo de 15 mL. Conte as células usando uma mancha azul de tripano para avaliar a viabilidade; recomenda-se uma diluição de 1:5. Só prossiga com o experimento se a viabilidade das células exceder 90%.

3. Iniciando o experimento, semeadura e estimulação das células

  1. Semear 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 em meio completo em uma placa de poço de área de superfície de 1 cm² que permite microscopia de alta qualidade. Use um volume final de 200 μL por poço.
  2. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Leve em consideração que alguns poços extras precisam ser semeados para controles de coloração, o que é explicado com mais detalhes na etapa 5.6.
  3. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, adicione um estímulo indutor de necroptose às células. Aqui, as células foram infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidade de infecção [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placas (pfu) divididas pelo número de células; o pfu foi quantificado usando um ensaio de placa em células Vero) por 6 h, 8 h ou 10 h.
  4. Como controle positivo para indução de necroptose, estimular as células por 4 h com um coquetel indutor de necroptose contendo 30 ng/mL de TNF, 20 μM do inibidor da pan-caspase zVAD-fmk e 5 μM do mimético SMAC BV6.
  5. Como controle negativo para a coloração p-RIPK3 (S227), inclua GSK'840 (1 μM) para inibir a atividade da quinase RIPK3 e prevenir a autofosforilação da S227. Idealmente, adicione o inibidor em uma condição não tratada e após a estimulação da necroptose. O inibidor pode ser adicionado simultaneamente com a infecção viral.
  6. Preparar as injeções em meio completo, pré-aquecidas a 37 °C. Use um volume final de 200 μL por poço para todas as estimulações.

4. Fixação das células

  1. Retire o meio e lave as células com 200 μL de 1x PBS. Em seguida, adicione 150 μL de PFA a 4% (já equilibrado à temperatura ambiente) às células e incube à temperatura ambiente por 30 min.
    Observação : se você estiver usando células que se desprendem facilmente, a fixação das células pode ser otimizada da seguinte maneira. Remova 100 μL de meio do poço, de modo que um volume de 100 μL permaneça na placa. Adicione 100 μL de 4% de PFA às células. Incubar as células durante 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, retire o meio/fixador dos poços e substitua por 150 μL de PFA a 4%. Incubar as células por mais 20 minutos à temperatura ambiente para garantir a fixação completa das células.
  2. Após a fixação, retire o PFA a 4% e lave as células 3x com 200 μL de PBS 1x. As amostras podem ser armazenadas em excesso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante a noite até processamento posterior.

5. Permeabilização e coloração primária

  1. Remova o PBS e adicione 100 μL de tampão de permeabilização (0,5% Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Retirar o tampão de permeabilização e, posteriormente, lavar os poços com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem por 5 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado (20-30 movimentos de balanço por minuto).
  3. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos primários, adicionar 100 μL de meio bloqueador e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, esta etapa de bloqueio pode ser substituída por bloqueio com 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
  4. Lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  5. Depois de remover o tampão de lavagem, adicionar os anticorpos primários à câmara de imagem e incubar durante a noite a 4 °C. Use um volume final de 100 μL para cobrir o poço. Durante a incubação durante a noite a 4 °C, não coloque a câmara de imagem num agitador de laboratório inclinado.
    NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluição: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluição: 1:200) compartilham coelho como espécie hospedeira e, portanto, não devem ser combinados em um poço. Para monitorar a infecção viral, combine um anticorpo primário contra uma proteína viral de escolha com p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Aqui, as células foram infectadas com infecção por HSV-1 seguida de coloração ICP0 (diluição: 1:50, espécie hospedeira: camundongo).
  6. Leve em consideração os controles de coloração necessários neste momento. Sempre inclua uma condição sem anticorpos primários para visualizar o contexto potencial da etapa de amplificação da TSA para definir o limiar de mascaramento (consulte a etapa 9).
    NOTA: No caso de um protocolo de cocoloração (por exemplo, combinando p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] com um anticorpo contra uma proteína viral), use também coloração única. O uso de manchas únicas é importante para corrigir possíveis sinais de sangramento em outros canais de imagem.

6. Amplificação de sinal de tiramida (TSA)

  1. Remova a mistura de anticorpos primários e lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  2. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 μL de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies de anticorpos primários que precisam ser amplificadas. Para amplificar o sinal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), adicione 100 μL de anti-coelho-HRP e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
    NOTA: Somente p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) serão amplificados. A coloração de uma proteína viral será visualizada usando um método padrão de coloração indireta.
  3. Posteriormente, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  4. Nas próximas etapas, adicione a tiramida biotinilada à placa microscópica. Usando o grupo HRP acoplado aos anticorpos secundários, a reação enzimática desencadeará a formação de radicais tiramida nas proximidades do alvo primário (aqui, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).
  5. Para ativar a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante juntamente com a tiramida biotinilada. Para conseguir isso, complemente o tampão TSA (0,1 M de ácido bórico [pH 8,5]) com 0,03 M H 2 O2; especificamente, tome 5 mL de tampão TSA e adicione 5 μL de 30% H 2 O2.
  6. Agora, dilua a biotina-tiramida em tampão TSA suplementadocom H 2O2, variando de 1:1.000 a 1:20.000.
    NOTA: O fator de diluição da biotina-tiramida precisa ser otimizado por lote.
  7. Remova o tampão de lavagem dos poços e adicione biotina-tiramida diluída aos poços a um volume final de 100 μL. Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado.
  8. Em seguida, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.

7. Fluoróforos

NOTA: Como o sinal do anticorpo primário é convertido em um grupo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) são visualizados usando estreptavidina acoplada a um fluoróforo (fluoróforo 568, diluição: 1:500). Além disso, os núcleos são corados com DAPI (5 μg/mL). Se uma proteína viral estiver incluída no protocolo de coloração, inclua um anticorpo secundário adequado marcado fluorescentemente contra a espécie hospedeira do seu anticorpo primário. Nos resultados representativos, foi utilizado um rato anti-ICP0. Como anticorpo secundário foi incluído um anticorpo caprino acoplado ao fluoróforo 633 (diluição: 1:1.000).

  1. Faça a mistura de coloração em tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS) contendo os anticorpos e manchas mencionados acima. Retire o tampão de lavagem, adicione 100 μL de mistura de coloração e incube à temperatura ambiente por 1 h em um agitador de laboratório inclinado. Mantenha a câmara de imagem protegida da luz a partir deste passo.
  2. Em seguida, lave os poços 2x com tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  3. Finalmente, lave os poços 2x com 1x PBS. Armazenar as amostras em excesso (> 200 μL) de 1x PBS até a obtenção de imagem. Alternativamente, submerja as amostras no meio de montagem para preservar a coloração. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal.

8. Imagem usando um microscópio confocal

  1. Ligue o microscópio confocal e os lasers pelo menos 10 minutos antes da imagem.
  2. Use um objetivo de imersão para sensibilidade. De preferência, use a ampliação objetiva de 40x ou 63x. Antes da imagem, limpe as objetivas de imersão com o limpador de lentes usando bolas de algodão apropriadas. Objetivos sujos (por exemplo, devido à poeira) podem resultar em imagens de menor qualidade.
  3. Coloque uma quantidade excessiva de óleo no fundo da câmara de imagem. Além disso, adicione uma gota de óleo no objetivo de escolha.
  4. Coloque a câmara de imagem no microscópio. Encontre o campo de foco usando a coloração DAPI ou usando imagens de campo brilhante. Se necessário, mova-se ao redor da câmara de imagem para garantir a disseminação adequada do óleo de imersão.
  5. Configure as trilhas de imagem necessárias no microscópio. Dependendo do microscópio, os passos a seguir podem variar (Tabela 1).
    NOTA: Ao configurar as trilhas de imagem, programe as trilhas para que a coloração nuclear seja medida por último. O laser de 405 nm pode contribuir para o fotobranqueamento e, assim, a perda de sinal específico em todos os canais.
  6. Para analisar uma célula completa quanto à presença de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), meça pilhas z que abrangem a altura da célula. Aqui, as pilhas z foram feitas de 40 fatias a cada 0,16 μm, resultando em um intervalo de 6,22 μm.

PistaLaserDivisor de feixeFiltro
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)561MBS -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gene Viral: ICP0633MBS -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Núcleo: DAPI405MBS -405 +BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabela 1: Faixas de imagem para visualização celular.

9. Análise e quantificação dos dados

  1. Carregue as imagens microscópicas para o software. Use o foco estendido para visualizar todas as informações da pilha z em uma imagem 2D.
  2. Em seguida, programe o protocolo de análise para extrair as seguintes informações: o número de células por imagem, a soma dos voxels mostrando a coloração p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+. Um voxel representa um volume tridimensional, definido como o equivalente tridimensional de um pixel.
  3. Para quantificar o número de células por imagem, segmente o núcleo. Para reduzir o ruído nos resultados da segmentação, adicione uma limitação de tamanho à segmentação (>100 μm³). O número de núcleos segmentados representa o número de células na imagem.
  4. Para quantificar a quantidade de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+, programe uma segmentação baseada em limiar. Defina o limite para que nenhum sinal seja captado nas imagens sem anticorpos primários (NP).
  5. Adapte ainda mais o limiar usando as imagens da condição simulada não tratada. Para garantir a detecção sensível do aumento do sinal devido à estimulação da necroptose, limite a captação de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ em condições simuladas, definindo um limiar mais alto. Sempre verifique o protocolo de análise programada em várias imagens da condição simulada e da infecção viral indutora de necroptose.
  6. Execute a análise em todos os conjuntos de imagens. Exporte a quantificação de voxel e a segmentação de núcleo em um arquivo de .txt para processamento adicional em software de planilha.
  7. Faça uma tabela dinâmica dos dados mostrando o nome da imagem, a quantificação do núcleo e a soma dos voxels detectados.
  8. Em seguida, divida a soma dos voxels positivos pela contagem de células na imagem. Isso resulta em um valor relativo de voxels positivos por célula. Para visualizar o aumento da dobra, divida o valor relativo de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ por célula pela mediana da condição não tratada (mock).

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Resultados

A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora26. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com coloração fluoresce...

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Discussão

Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já presente nas amostras...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), consórcios CRIG e GIGG e VIB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpos
Anti-coelho HRPAgilent Technologies BélgicaK4002Envision+ System-HRP Polímero Marcado Anti-coelho
Cabra anti-rato DyLight 633Thermofisher35513Anticorpo secundário
HSV-1 ICP0 SantaCruzsc-53070Camundongo anti-ICP0(HSV-1) anticorpo
Soro de camundongo IAV-PR8Produção internaxxAnticorpo policlonal anti-IAV-PR8 de camundongo
pMLKLAbcamab187091Anticorpo anti-MLKL-fosfo S358 de coelho
pRIPK3Abcamab209384Coelho anticorpo anti-RIPK3-fosfo S227
< forte > fluoróforos< / forte >
DAPIThermofisherD21490Para visualizar o núcleo das células
Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Para visulalizar moléculas de biotina
Compounds
30% H2O2SigmaH1009Substrato oxidante, necessário para a atividade HRP
4% PFASANBIOAR1068Para fixar/reticular as células
Biotinil-tiramidaR& D Systems6241Para amplificar o sinal, substrato HRP
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
         Para cultura de células: para separar as células
         8,0 g/L de NaCl
         0,4 g/L de sal dissódico de EDTA
EDTA 0,04%Formulação1,1 g/L Na2HPO4
         0,2 g/L NaH2PO4
         0,2 g/L KCl
         0,2 g/L Glicose
Soro bovino fetalTICOFBS EU XXXPara cultura de células, mantendo a cultura de células; número de lote: 90439
GSK'840Inibidor de quinase AOB0917 RIPK3Aobious
L-GlutaminaSigma-AldrichG7513Para cultura de células, mantendo a cultura de células
MAXblockActive Motif15252Solução de bloqueio
PBSGibco
piruvato de sódioSigma-AldrichS8636Para cultura de células, mantendo a cultura de células
TNF-αMolécula de sinalização de produção interna, capaz de desencadear a morte celular em combinação com BV6 e zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLPara permeabilizar as células
Trypan blueMerck11732Para contagem de células, usado como marcador vivo / morto a 0,1%
TrypsineSigma-AldrichT4424Para cultura de células: para separar as células
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona
Material
µ-Slide 8 poços de fundo de vidro altoiBidi80807Para cultivar as células
Bolas de preparação de algodão-tamanho médioMicroscopia eletrônica Ciências71001-10Para limpar as objetivas
Immersol 518 F / 30 ° CZEISS444970-9000-000Para visualizar a amostra em grandes ampliações
Limpador de lentesZEISS000000-0105-200Para limpar as objetivas
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Vírus
Cepa HSV-1 (mutRHIM) Fproduzida por  Dr. Jiahuai Hanreplicação internaHSV-1 como um gatilho para necroptose; O domínio central RHIM de UL39 / ICP6 é mutado (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) Cepa FProduzido pelo Dr. Jiahuai Hanem replicação internaHSV-1 (WT) como um controle negativo para indução de necroptose (inibição de ICP6)
IAV PR8em estoque domésticoem casa replicação IAVcomo um gatilho para necroptose
interna 10444402 confocal Fast Airyscan

Referências

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).

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