A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.
Introdução
A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após inter....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação de tiramida biotinilada
- Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.
2. Manutenção das células HT-29 em cultura
NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor27 que codifica ZBP1 humano.
- Manter as células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy suplementadas com L-glutamina, sódio-piruvato e 10%....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora26. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com coloração fluoresce.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já presente nas amostras.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BO....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos | |||
| Anti-coelho HRP | Agilent Technologies Bélgica | K4002 | Envision+ System-HRP Polímero Marcado Anti-coelho |
| Cabra anti-rato DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Anticorpo secundário |
| HSV-1 ICP0 Santa | Cruz | sc-53070 | Camundongo anti-ICP0(HSV-1) anticorpo |
| Soro de camundongo IAV-PR8 | Produção interna | xx | Anticorpo policlonal anti-IAV-PR8 de camundongo |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Anticorpo anti-MLKL-fosfo S358 de coelho |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Coelho anticorpo anti-RIPK3-fosfo S227 |
| < forte > fluoróforos< / forte > | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Para visualizar o núcleo das células |
| Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | Para visulalizar moléculas de biotina |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Substrato oxidante, necessário para a atividade HRP |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | Para fixar/reticular as células |
| Biotinil-tiramida | R& D Systems | 6241 | Para amplificar o sinal, substrato HRP |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| Para cultura de células: para separar as células | |||
| 8,0 g/L de NaCl | |||
| 0,4 g/L de sal dissódico de EDTA | |||
| EDTA 0,04% | Formulação | 1,1 g/L Na2HPO4 | |
| 0,2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0,2 g/L KCl | |||
| 0,2 g/L Glicose | |||
| Soro bovino fetal | TICO | FBS EU XXX | Para cultura de células, mantendo a cultura de células; número de lote: 90439 |
| GSK'840 | Inibidor de quinase AOB0917 RIPK3 | Aobious | |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | Para cultura de células, mantendo a cultura de células |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Solução de bloqueio |
| PBS | Gibco | ||
| piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | S8636 | Para cultura de células, mantendo a cultura de células |
| TNF-α | Molécula de sinalização de produção interna | , capaz de desencadear a morte celular em combinação com BV6 e zVAD | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Para permeabilizar as células |
| Trypan blue | Merck | 11732 | Para contagem de células, usado como marcador vivo / morto a 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | Para cultura de células: para separar as células |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona |
| Material | |||
| µ-Slide 8 poços de fundo de vidro alto | iBidi | 80807 | Para cultivar as células |
| Bolas de preparação de algodão-tamanho médio | Microscopia eletrônica Ciências | 71001-10 | Para limpar as objetivas |
| Immersol 518 F / 30 ° C | ZEISS | 444970-9000-000 | Para visualizar a amostra em grandes ampliações |
| Limpador de lentes | ZEISS | 000000-0105-200 | Para limpar as objetivas |
| LSM880 Microscópio | Para visualizar a amostra | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | Para processar os dados |
| Prisma 9 | Graphpad | xx | Para analisar os dados - testes estatísticos e geração de gráficos |
| Volocidade 6.3 | Volocidade | xx | Para realizar quantificações |
| Zen black | ZEISS | xx | Para adquirir e processar imagens |
| Zen blue | ZEISS | xx | Para visualizar imagens |
| Vírus | |||
| Cepa HSV-1 (mutRHIM) F | produzida por Dr. Jiahuai Han | replicação interna | HSV-1 como um gatilho para necroptose; O domínio central RHIM de UL39 / ICP6 é mutado (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) Cepa F | Produzido pelo Dr. Jiahuai Han | em replicação interna | HSV-1 (WT) como um controle negativo para indução de necroptose (inibição de ICP6) |
| IAV PR8 | em estoque doméstico | em casa replicação IAV | como um gatilho para necroptose |
Referências
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
