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O Isolamento da Linfa Mesentérica Corrente em Camundongos para Quantificar a Cinética In Vivo de Absorção de Lipídios da Dieta e Secreção de Quilomícrons

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DOI:

10.3791/64338

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30 de novembro de 2022

 ,  , 
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um protocolo cirúrgico detalhado para o isolamento de linfa intestinal corrente em resposta a infusões intraduodenais de nutrientes em camundongos. Isso permite a determinação fisiológica da absorção de lipídios intestinais totais e da síntese e secreção de quilomícrons em resposta a vários nutrientes experimentais.

Resumo

As lipoproteínas intestinais, especialmente os quilomícrons ricos em triglicerídeos, são um importante impulsionador do metabolismo, inflamação e doenças cardiovasculares. No entanto, isolar as lipoproteínas intestinais é muito difícil in vivo porque elas são secretadas primeiro do intestino delgado para os linfáticos mesentéricos. A linfa contendo quilomícron então desemboca na veia subclávia do ducto torácico para entregar componentes da refeição ao coração, pulmões e, finalmente, à circulação de todo o corpo. O isolamento de quilomícrons virgens é impossível do sangue, uma vez que o triglicerídeo de quilomícron sofre hidrólise imediatamente após a interação com a lipase lipoproteica e outros receptores de lipoproteínas na circulação. Portanto, o procedimento original de fístula linfática de 2 dias, descrito por Bollman et al., em ratos, tem sido historicamente usado para isolar a linfa mesentérica fresca antes de sua entrada na veia torácica. Esse protocolo foi aprimorado e profissionalizado pelo laboratório de Patrick Tso nos últimos 45 anos, permitindo a análise dessas lipoproteínas e secreções críticas do intestino. O procedimento de fístula linfática Tso foi atualizado e é apresentado aqui visualmente pela primeira vez. Este procedimento revisado é uma técnica cirúrgica de um dia para instalar uma sonda de alimentação duodenal, canular o ducto linfático mesentérico e coletar linfa após uma refeição em camundongos conscientes. Os principais benefícios dessas novas técnicas incluem a capacidade de coletar linfa de camundongos de forma reprodutível (o que aproveita o poder dos modelos genéticos de camundongos); a redução do tempo de anestesia para camundongos durante o implante do tubo de infusão duodenal e da cânula linfática; a capacidade de coletar continuamente linfa durante todo o período de alimentação e pós-prandial; a capacidade de medir quantitativamente hormônios e citocinas antes de sua diluição e hidrólise enzimática no sangue; e a capacidade de coletar grandes quantidades de linfa para isolar lipoproteínas intestinais. Esta técnica é uma ferramenta poderosa para medir direta e quantitativamente a absorção de nutrientes da dieta, a síntese de lipoproteínas intestinais e a secreção de quilomícrons.

Introdução

A importância fisiológica do sistema linfático mesentérico
Os linfáticos mesentéricos têm sido descritos de alguma forma desde ~300 a.C., quando Herófilo descreveu o sistema porta hepático e todas as "veias absortivas nos intestinos"1,2,3,4,5. Por mais de 1.700 anos após essa descrição inicial, uma característica definidora dos linfáticos intestinais foi a presença de líquido leitoso na linfa mesentérica logo após uma refeição3. Sabe-se atualmente que a linfa leitosa contendo quilomícrons ("linfa quilosa") não drena para a veia porta e o fígado, mas viaja através da cisterna quilo para o ducto torácico e, finalmente, une o sangue na veia subclávia esquerda6. Devido a esse arranjo anatômico, a linfa quilosa viaja primeiro pelo coração e pulmões antes de circular pelo resto do corpo. Isso significa que o coração e os pulmões recebem uma "primeira passagem" nas secreções para a linfa mesentérica7.

Um papel importante dos linfáticos mesentéricos é o transporte de lipídios dietéticos do intestino delgado 8,9,10. Anatomicamente, quilomícrons, células imunes intestinais 11,12,13,14, hormônios intestinais 15,16,17,18, antígenos 19,20,21, compostos lipofílicos não quilomícrons 22,23 , e o excesso de líquido entra nos lacteanos subjacentes à membrana basal dos enterócitos e então se concentra através dos capilares linfáticos até os linfonodos mesentéricos. Há provavelmente muitos componentes linfáticos mesentéricos desconhecidos, incluindo metabólitos, antígenos, contaminantes ambientais, nutrientes e moléculas de sinalização.

Os componentes da linfa mesentérica não têm sido sistematicamente identificados, em grande parte devido à dificuldade de isolar a linfa mesentérica. O acesso à linfa mesentérica sempre foi um sério desafio, pois os ductos linfáticos são incolores e, exceto após uma refeição gordurosa, quando se tornam quilosos e leitosos, os linfáticos mesentéricos contêm líquido linfático incolor 6,8,9,10.

Métodos atuais e comuns para o isolamento da linfa intestinal
A linfa mesentérica não pode ser acessada em humanos (exceto em circunstâncias raras e extremas em que ocorreu trauma gastrointestinal grave)24. A coleta de linfa in vivo é cirurgicamente complexa e exigente. O procedimento original de fístula linfática de 2 dias foi descrito por Bollman et al.25 e vem sendo aprimorado e profissionalizado pelo laboratório de Patrick Tso nos últimos 45 anos26,27. O procedimento de fístula linfática permite que os investigadores coletem linfa fluindo de animais conscientes durante um período de infusão duodenal de lipídios de 6 horas.

O modelo de fístula linfática tem sido usado principalmente em ratos para medir a taxa de fluxo linfático, a saída de triglicérides e colesterol (ou outros compostos infundidos duodenal), composição de quilomícrons e concentrações de hormônios intestinais. Em menor grau, essa técnica também pode ser usada em camundongos, embora a sobrevida cirúrgica e o volume linfático sofram. Devido às dificuldades em ver os ductos linfáticos mesentéricos, métodos históricos incluíram a canulação da linfa mesentérica em animais maiores, como miniporcos28, ovelhas29, porcos30, cães31 e ratos17. Trabalhar com esses modelos maiores é intensivo em recursos e não permite estudos em modelos knock-in ou knock-out.

Abordagens alternativas também têm sido utilizadas. Os quilomícrons podem ser isolados do sangue no estado pós-prandial (embora estes sejam parcialmente hidrolisados pela lipase lipoprotéica plasmática)32,33,34,35. O ducto torácico também pode ser canulado, embora a linfa ali coletada contenha mistura de linfa mesentérica e drenagem linfáticaextra-intestinal 26,36. In vitro, as células Caco-2 secretam uma partícula semelhante a quilomícron em resposta ao tratamento com ácidos graxos, e essas células podem ser co-cultivadas com células endoteliais linfáticas ou vasculares importantes37,38. Foi demonstrado que culturas organoides intestinais humanas e de camundongos processam lipídios apicais e secretam quilomícrons 39,40,41,42. Esses modelos são altamente vantajosos e permitem insights mecanicistas sobre a fisiologia do intestino delgado, mas não podem replicar a complexidade, os gradientes físico-químicos ou o fluxo linfático dinâmico dos linfáticos mesentéricos in situ.

Vantagens do modelo de fístula linfática de camundongo de 1 dia apresentado aqui
Com relação a esses outros métodos de isolamento das lipoproteínas intestinais, a técnica de fístula linfática Tso Lab tem sido tradicionalmente considerada a técnica padrão-ouro para medir a absorção de nutrientes dietéticos na linfa mesentérica. Esta técnica in vivo tem a vantagem de capturar os principais aspectos fisiológicos da absorção lipídica da dieta - o aparecimento dinâmico dos compostos ao longo do período de absorção, o que requer a amostragem repetida de linfa mesentérica fluindo em animais vivos com nutrientes duodenais. Essa técnica cirúrgica também mede hormônios e citocinas intestinais diretamente em seu compartimento fisiológico e não no sangue, onde são diluídas e degradadas enzimaticamente17,43.

Se a questão experimental requer uma compreensão da dinâmica da secreção lipídica ou da absorção dinâmica e metabolismo de qualquer composto ou fármaco hidrofóbico GI, então esta técnica não é apenas apropriada, mas também é a única abordagem que interpola o movimento do conteúdo luminal do intestino proximal para o distal (estômago para cólon) e da superfície apical para a basolateral (conteúdo luminal através de enterócito para lacteal e circulação portal). Como esta técnica emprega a entrega luminal de nutrientes através do cateter intraduodenal, e como a linfa mesentérica que flui é desviada e coletada, todo o aparato de absorção está sob controle experimental e pode ser usado para avaliar qualitativamente o perfil de absorção do intestino delgado.

Apresenta-se visualmente pela primeira vez aqui uma grande atualização do modelo de fístula linfática Tso Lab, que (1) reduz o tempo experimental para 1 dia de implantação cirúrgica e período de coleta experimental; (2) melhora as considerações relativas à sobrevivência e ao bem-estar dos animais; e (3) aumenta a reprodutibilidade da abordagem em camundongos para aproveitar o poder dos modelos genéticos de camundongos. Esta técnica deve ser considerada um padrão-ouro para todas as questões experimentais de secreção intestinal, lipoproteínas ou absorção de lipídios na dieta e é a melhor técnica para a determinação de alta fidelidade da cinética de absorção de lipídios e quilomícrons.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Interno de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh [Protocolo # 20047008] e estão em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos machos C57BL6/J, com 8-14 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os camundongos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum à ração padrão e água.

1. Preparo dos animais

  1. Dependendo do desenho experimental, alimente os camundongos ou deixe-os jejuar.
    NOTA: Um jejum noturno é desnecessário, a menos que haja preocupações sobre diferenças na taxa de esvaziamento do estômago.
  2. Induzir anestesia com gás isoflurano a 5% e garantir a anestesia adequada por pinça da cauda e dos dedos. Uma vez anestesiados, manter os camundongos em plano anestésico adequado com gás isoflurano a 2%-3% e posicioná-los com fita adesiva na plataforma cirúrgica.
  3. Mantenha os ratos aquecidos em uma plataforma cirúrgica aquecida que utilize água quente circulante (consulte a Tabela de Materiais).

2. Cirurgia e delineamento experimental

  1. Inicie a cirurgia aplicando pomada veterinária nos olhos, raspando o abdômen e aplicando esfoliação cirúrgica antisséptica (ver Tabela de Materiais) no local da cirurgia. Isso esteriliza a incisão e reduz a geração de pelos transportados pelo ar durante a incisão mediana.
  2. Mantenha uma área de trabalho estéril utilizando instrumentos estéreis, campos e outros equipamentos e suprimentos necessários.
  3. Injetar a primeira dose de carprofeno (ver Tabela de Materiais) para alívio da dor (i.p.) na dose de 5 mg/kg.
  4. Segure a pele com uma pinça e faça uma incisão abdominal mediana com uma tesoura pequena. Corte em direção ao esterno (nunca acima) e corte até a gordura inguinal. Em seguida, corte a camada muscular separadamente usando a tesoura.
    OBS: Esterilizar todos os equipamentos antes do uso.
  5. Usando o afastador, mova as vísceras peritoneais para fora do caminho até que o ducto linfático esteja visível.
  6. Usando uma ponta Q embebida em soro fisiológico (ver Tabela de Materiais), mova o fígado para o lado superior direito do corpo e os intestinos e estômago para a esquerda do animal.
  7. Esticar o duodeno em direção à esquerda transversalmente para expor a artéria mesentérica superior e o ducto linfático intestinal.
  8. Prepare um tubo de cânula de 30-40 cm de comprimento inserindo uma agulha romba no tubo da cânula (ver Tabela de Materiais) e lave uma pequena quantidade de heparina (1.000 U/L) através do tubo usando uma seringa de 1 mL.
    NOTA: O fluxo linfático é assistido pela gravidade para fluir para baixo e para dentro dos tubos de coleta de microcentrífugas no gelo. Dependendo de onde o balde de gelo de coleta está localizado adjacente ao arranjo cirúrgico, o comprimento da tubulação da cânula pode precisar ser ajustado.
  9. Use uma tesoura para cortar um bisel na ponta da tubulação da cânula.
  10. Faça uma incisão rasa com tesoura de íris (ver Tabela de Materiais) no ducto linfático a aproximadamente 5 mm de seu aparecimento no intestino delgado.
  11. Segure a tubulação da cânula com um par de pinças finas e insira suavemente o bisel da ponta no duto.
    NOTA: É importante não empurrar a cânula muito para dentro do ducto, porque isso pode impedir o fluxo linfático quando os órgãos retraídos são devolvidos à sua posição original.
  12. O ducto linfático é muito frágil para as manipulações associadas à amarração do cateter com uma sutura. Em vez disso, use uma gota de cola de cianoacrilato (ver Tabela de Materiais) para colar a cânula linfática no ducto linfático mesentérico.
  13. Verifique se há linfa leitosa, branca (se a gavagem de azeite pré-cirurgia foi usada) ou linfa clara (se os ratos tiverem jejuado antes da cirurgia) que começa a fluir imediatamente através da cânula da fístula linfática.
    NOTA: Verifique se a cânula linfática foi colocada com sucesso e se a linfa está fluindo; continuar com a colocação da cânula intraduodenal.
  14. Com uma agulha de 18 G, puncione um orifício através da região pilórica do estômago posterior ao esfíncter pilórico.
  15. Insira o tubo de perfusão duodenal (ver Tabela de Materiais) através desse orifício no estômago até aproximadamente 1-2 mm além do esfíncter pilórico no duodeno.
  16. Fixar por uma ligadura de corda em bolsa usando sutura de seda 5-0 (ver Tabela de Materiais) com uma agulha até o estômago e selar com uma gota de cola de cianoacrilato para evitar vazamentos.
  17. Iniciar a infusão intraduodenal de solução fisiológica a 0,9% de glicose a 5% a 0,3 mL/h.
    NOTA: Ao usar camundongos com pequenas variações no peso corporal que têm aproximadamente 25 g (~8 semanas de idade), a infusão de 0,3 mL/h de glicose/soro fisiológico é apropriada. Se os ratos forem dramaticamente maiores, a taxa de perfusão deve ser ajustada para cima para ter em conta a alteração do peso corporal e do volume sanguíneo.
  18. Substitua os órgãos na cavidade do corpo e suture (5-0) os tecidos muscular e cutâneo separadamente.
    NOTA: A cânula linfática e a sonda de alimentação intraduodenal são exteriorizadas através da mesma incisão. Não há precedência para separação dos tubos com sutura e não há preferência pelo ângulo de exteriorização dos tubos.
  19. Após a cirurgia, mas antes da retirada do anestésico, coloque os ratos suavemente em contenções Snuggle (ver Tabela de Materiais) para limitar a motilidade.
    NOTA: Os aconchego impedem que os ratos agarrem ou girem a cabeça para mastigar os pontos e tubos.
  20. Em seguida, coloque os ratos em uma caixa de plexiglass transparente em um rotador com balanço suave e aqueça usando uma almofada de aquecimento de anfíbios/répteis comercialmente disponível com temperatura controlada aderida ao lado da caixa de contenção. Fornecer umidificação também na forma de recipientes de água deionizada estéril nos cantos da caixa de contenção (consulte a Tabela de Materiais).
  21. Aos 30 minutos antes da retirada do isoflurano, administrar aos camundongos sua segunda dose de alívio da dor (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. Dependendo do experimento, fornecer aos camundongos uma infusão intraduodenal contínua de solução salina a 5% de glicose-0,9% a uma taxa de 0,3 mL/h por 1 h.
    NOTA: A solução salina de glicose a 0,9% a 5% é preparada usando uma bolsa de soro fisiológico estéril (para uso humano, pH 7,4) da farmácia e um frasco estéril para uso humano de dextrose a 50%, seguindo diretrizes rigorosas de esterilidade. A solução deve ser fresca e eliminada se ultrapassar as datas de validade fornecidas no saco de soro fisiológico ou no frasco de dextrose.
  23. Administrar os ratinhos com um dos lípides listados na Tabela 1 como lipídio experimental através de uma cânula intraduodenal (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Para todos os dados mostrados na Figura 1, SMOFlipid (emulsão injetável lipídica a 20%, USP, ver Tabela de Materiais) foi infundido intraduodenalmente. Essa infusão, tanto pré quanto pós-intraduodenal lipídica em bolus, repõe o líquido perdido que drena pelo ducto linfático e é uma necessidade absoluta. Os camundongos estão agora prontos para serem infundidos com uma dose lipídica experimental.
  24. Realizar a infusão lipídica clássica de um bolus de emulsão lipídica de 0,3 mL (SMOFlipid 20% lipid injetable emulsion, USP) através do tubo de infusão intra-duodenal (ver Tabela de Materiais).
  25. Após a infusão em bolus de lipídios intraduodenais, troque a infusão de volta para solução salina a 5% de glicose a 0,9% a 0,3 mL/h continuamente até o final do experimento.
  26. Coletar as amostras de linfa em tubos de microcentrífuga pré-pesados por 60 min e manter a linfa no gelo. Pese os tubos uma segunda vez para estabelecer o peso da linfa que é secretada a cada período de 60 min.
    NOTA: Espere coletar aproximadamente 50-300 μL de linfa por hora, por camundongo em ~6 h após um bolus lipídico de 0,3 mL.
  27. A linfa pode fluir por até 6 h após a infusão lipídica. No tempo de 6 h, eutanasiar os camundongos via isoflurano e deslocamento cervical.
    OBS: Um cirurgião e/ou técnico de laboratório deve estar presente para monitorar os animais durante todo o experimento. Durante a observação, fique atento a coágulos na drenagem linfática e alterações no comportamento animal que indiquem dor/angústia. Se o ducto linfático for entupido em algum momento durante o experimento, o experimento é encerrado e o animal é sacrificado. O animal pode tecnicamente ser mantido vivo por até 24 h após a cirurgia (de acordo com as regras de cirurgia de sobrevivência da IACUC). No entanto, as taxas de sobrevivência diminuem com o tempo, e 6 h é um período de sobrevivência reprodutível, onde a absorção de lipídios ainda mimetiza a fisiologia in vivo , e o animal não está lutando com a sobrevivência.
  28. Realizar coleta de tecido terminal após a eutanásia (passo 3.1).
    NOTA: A diferença nos perfis de absorção de lipídios dietéticos em camundongos mantidos por 6 horas ou 24 horas após a cirurgia foi recentemente testada44. Verificamos que o procedimento de 24 horas reduz as taxas de sobrevivência dos animais e a excursão de lipídios dietéticos para a linfa. Por essas razões, recomendamos fortemente a abordagem de 6 horas. Este desenho cirúrgico atualizado reduz a morte desnecessária do animal e o potencial de sofrimento animal no período pós-cirúrgico. Isso apoia um grande objetivo da American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, que é a "Substituição, Redução, Refinamento" de animais [ref PMID: 21595115].

3. Coleta de conteúdo luminal e tecido mucoso

  1. Ao final do período de 6 h de infusão lipídica, sacrificar os camundongos via isoflurano e deslocamento cervical. Amarre ambas as extremidades do estômago, intestino delgado e ceco com suturas 5-0 para evitar vazamento do conteúdo luminal.
  2. Colete o estômago, o ceco e o cólon e coloque cada um em um tubo de vidro de 15 mL. Divida o intestino delgado em três ou quatro segmentos e colete o conteúdo luminal enxaguando o tecido em 2-3 mL de PBS frio após o corte longitudinal.
  3. Remover a mucosa intestinal composta por células epiteliais e lâmina própria associada da camada muscular raspando cada corte em 2-3 mL de PBS frio com um tweezer curvo.
  4. Colocar todos os tecidos, os isolados luminal e mucoso e a camada muscular em tubos de vidro e adicionar 8 mL de CHCl3:MeOH 2:1 vol/vol a cada tubo.
  5. Determinar a radioactividade e/ou as concentrações de lípidos através da contagem de cintilação líquida e/ou de um kit de ensaio de triglicéridos (ver Tabela de Materiais) após a extracção de Folch45.

4. Cromatografia em camada delgada (CCD)

  1. Extrair os lipídios totais dos isolados luminais e da mucosa através de uma extração modificada de Folch45.
  2. Secar os lipídios extraídos no solvente sob um evaporador de nitrogênio e, em seguida, ressuspendê-los em 2:1 vol/vol de CHCl3:MeOH antes de carregá-los em uma placa de sílica gel TLC (ver Tabela de Materiais).
  3. Separe os lipídios usando um sistema solvente de éter de petróleo, éter etílico e ácido acético glacial (25:5:1 vol/vol/vol). Use vapor de iodo para a visualização de diferentes lipídios, incluindo padrões.
  4. Raspar os pontos na placa de CCD correspondentes a monoglicerídeos/fosfolipídios, diglicéridos, ácidos gordos, triglicéridos e éster de colesterol em frascos de cintilação individuais antes da adição de 4 ml do fluido de cintilação (ver Tabela de Materiais) para contagem de cintilação.
  5. Exprimir os dados em percentagem da dose total de lípidos em bolus ou em fracção do lípido total detectado para cada amostra.

5. Isolamento e caracterização de quilomícrons

  1. Transferir as amostras de linfa combinadas do bolus pós-lipídico de 6 h (passo 2,29) para tubos de ultracentrífuga, misturados com NaCl a 0,9% (300-500 μL), e então cuidadosamente sobrepostos com um volume apropriado de NaCl a 0,87% (300-500 μL).
    1. Ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) das amostras a 110.000 x g a 4 °C por 16 h. Coletar a fração superior contendo quilomícrons isolados e transferi-los para um novo tubo de microcentrífuga.
  2. Determine as concentrações de triglicerídeos, colesterol e apoB de quilomícrons seguindo as etapas abaixo.
    1. Determine as concentrações de triglicerídeos e colesterol usando um kit de ensaio de triglicérides e colesterol (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Resumidamente, incubar 2 μL das amostras com 200 μL de reagente enzimático a 37 °C por 5 min em uma placa de 96 poços. Leia a placa usando um leitor de placas a 500 nm para triglicerídeos e 600 nm para colesterol.
      OBS: Padrões e espaços em branco foram utilizados para o cálculo das concentrações. As concentrações de ApoB foram determinadas usando o Kit ELISA ApoB de Camundongo (ver Tabela de Materiais).
  3. Determinar o tamanho da partícula de quilomícron.
    1. Use amostras frescas de quilomícrons em concentrações de triglicérides em torno de 40 mg/dL para imagens de TEM. Resumidamente, coloque 5-10 μL de cada amostra em uma grade de MET e seque.
    2. Examine a grade com um microscópio eletrônico de transmissão e capture imagens. Meça os tamanhos das partículas de lipoproteínas e analise-as usando o software ImageJ (consulte Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 2 mostra a secreção de triglicérides na linfa mesentérica e as taxas médias de fluxo linfático nos camundongos n = 17 selvagens (WT) mais recentes que foram submetidos ao procedimento de fístula linfática de um dia descrito aqui. Como mostrado na Figura 2A, a concentração de triglicérides na linfa aumenta em resposta a um bolus intraduodenal de 300 μL de SMOFLipid. O pico de concentração de triglicerídeos é atingido em ~2-3 h pós-bolus e diminui constantemente ao longo do tempo de 6 h (imediatamente antes da eutanásia). Paralelamente à secreção de triglicérides, o fluxo linfático aumenta a partir do tempo 0 de infusão em bolus até o final do experimento (Figura 2B).

Esses resultados mostram que o implante cirúrgico tanto do ducto linfático mesentérico quanto da cânula intraduodenal ocorreram e são representativos de um controle positivo ao qual outros conteúdos linfáticos (hormônios, peptídeos, nutrientes) poderiam ser avaliados. Se não houver alteração na concentração de triglicérides na linfa em resposta aos lipídios intraduodenais em bolus, isso sinaliza que a cirurgia causou danos significativos ao intestino delgado de modo que a capacidade de absorção de lipídios está ausente, ou, em modelos genéticos não fenotipados anteriormente, isso sugeriria que o camundongo tem um defeito na absorção de lipídios que é fisiologicamente significativo.

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Figura 1: Linha do tempo proposta para o modelo de fístula linfática em camundongos. T-4, T-3, T-2: A dupla canulação leva aproximadamente 2-4 h, seguida pela colocação dos camundongos em câmaras de recuperação. T-1: Uma vez que os camundongos estão no período de recuperação, eles recebem uma infusão duodenal contínua de 5% de glicose-0,9% de solução salina. T0: a infusão intraduodenal contínua é trocada de solução salina a 5% de glicose-0,9% para uma infusão de nutrientes experimentais. T0-T6: Camundongos recebem glicose intraduodenal contínua a 5% em solução salina ou, alternativamente, nutrientes contínuos. A linfa é coletada de hora em hora durante esse período. Ponto final: Os ratos são eutanasiados e os tecidos podem ser coletados. A figura foi criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Concentração e fluxo de triglicérides da linfa mesentérica. Camundongos selvagens foram equipados com um tubo de alimentação intraduodenal e uma cânula de linfa mesentérica. Os camundongos receberam uma infusão em bolus de 300 μL de lipídio. A linfa foi coletada por 6 h em alíquotas horárias e mantida em gelo. (A) O conteúdo de triglicérides de linfa foi determinado por um ensaio químico em cada alíquota horária de linfa. (B) Nas 6 h após a infusão em bolus, o fluxo linfático é plotado como gramas de linfa secretada por hora. Pontos são meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Métodos de entrega de lipídiosRecomendações/Instruções
Emulsão lipídica mista em bolusUma dose de 0,3 mL de ( A ) Liposyn III 20% lipídico injetável ou (B) SMOFlipid 20% emulsão lipídica injetável, USP, via tubo de infusão intra-duodenal pode ser usada. Esses lipídios emulsionados são úteis porque não precisam ser preparados com antecedência, são líquidos à temperatura ambiente, são estéreis e porque contêm uma mistura "facilmente digerível" de ácidos graxos livres, triglicerídeos, fosfolipídios e taurocolato de sódio. Esta é uma boa infusão inicial para camundongos que podem ter insuficiências pancreáticas ou biliares.
Bolus de triglicerídeos0,3 mL de azeite aquecido suavemente (ou trioleína purificada) como um lipídio neutro que reflete uma dieta rica em gordura insaturada, banha de porco (reflexo de uma dieta com alto teor de gordura saturada) ou óleo de coco (reflexo de uma dieta com alto teor de triglicérides de cadeia média) podem ser administrados por tubo de infusão intra-duodenal ou gavagem oral. Se o triglicerídeo experimental estiver saturado, ele deve ser aquecido para ser líquido à temperatura ambiente.
Bolus de refeição mista0,3 mL Garantir com a formulação contendo 0,075 g de gordura (21,6%), 0,5 g de carboidrato (64,0%) e 0,1125 g de proteína (14,4%) e reflete uma refeição mista com baixo teor de gordura, pode ser administrado via infusão intra-duodenal.
Bolus lipídico radiomarcado5,0 μCi 3 trioleato de glicerol marcado com H e/ou 1,0 μCi 14C-colesterol em 0,3mL de azeite podem ser administrados por infusão intra-duodenal. 14º C-colesterol: Colesterol-[4-14C] com atividade específica de 55Ci/mmol e concentração de 0,1mCi/mL. 3º H-TG Trioleína [9,10-3H(N)] (3H-TG) com atividade específica de 60Ci/mmol e concentração de 1mCi/mL
Dose contínuaA infusão de qualquer uma das formulações experimentais de nutrientes acima a uma taxa de 0,3 mL/h (em vez de 0,3 mL em bolus total), resultará em uma saída constante de triglicérides para a linfa. Isso difere de uma infusão em bolus, onde a concentração de triglicérides na linfa atinge o pico em ~2–3 h e, em seguida, retorna às concentrações basais em ~6–8 h.

Tabela 1: Tabela de infusões lipídicas.

Discussão

O procedimento original de fístula linfática de 2 dias foi descrito por Bollman et al.25 e praticado pelo laboratório de Patrick Tso nos últimos 45 anos26,27. O protocolo apresentado aqui é uma adição poderosa a este método clássico padrão-ouro para identificar, quantificar e entender as secreções quilosas únicas do intestino delgado, bem como a dinâmica in vivo da absorção e metabolismo de nutrientes dietéticos, hormônios intestinais e imunidade intestinal.

As vantagens desse modelo incluem (1) a capacidade de coletar continuamente linfa mesentérica durante todo o período de alimentação e pós-prandial, em vez de amostragem estática em um ponto de tempo durante a absorção, digestão ou secreção; (2) a dosagem de hormônios e citocinas intestinais diretamente em seu compartimento fisiológico e não no sangue, onde são diluídas e degradadas enzimaticamente17,44; (3) a capacidade de isolar, quantificar e caracterizar as lipoproteínas secretadas pelo intestino delgado após a ingestão de uma refeição lipídica e a ausência de lipases endoteliais na linfa mesentérica, o que preserva as concentrações de triglicérides do quilomícron e a estrutura do quilomícron nativo46,47; (4) a capacidade de medir diretamente o fluxo linfático, a produção de triglicérides e colesterol (ou outros compostos infundidos duodenal), a composição de quilomícrons e as concentrações de hormônios intestinais. Finalmente, este protocolo permite coletar quantidades relativamente grandes de >50 μL de linfa a cada hora durante um período de 6 horas. À medida que o líquido é reabastecido com soro fisiológico intra-duodenal e infusão de glicose, o modelo de fístula linfática é significativamente melhorado em relação a outras técnicas de amostragem de linfa e resulta em pools fluidos em vez de estáticos de linfa mesentérica. Como o volume é um grande obstáculo para as abordagens lipidômica, proteômica e metabolômica, esse é um grande obstáculo.

O protocolo de fístula linfática de camundongo de 1 dia descrito aqui tem várias vantagens sobre o protocolo original de fístula linfática, incluindo uma redução no número total de animais experimentais em relação aos protocolos de fístula linfática de 2 dias descritosanteriormente26,27 devido a uma maior taxa de sobrevida após a cirurgia; redução do tempo experimental total de 2 dias para um único dia; e, finalmente, uma redução no período de recuperação para camundongos de durante a noite (>18 h), onde pode ocorrer dor de ruptura ou resultados pós-cirúrgicos ruins, para um período de ~6 h pós-cirurgia mais gerenciável.

Uma característica deste protocolo de 1 dia é o foco em considerações humanas e endpoints. Estes devem ter a maior prioridade: (1) os animais devem receber fluidos de reposição intraduodenal ou IV; (2) devem ser mantidos aquecidos e o mais indolor possível (com Buprenex e/ou carprofeno no pós-operatório, dependendo do desenho experimental e da necessidade de evitar efeitos anti-inflamatórios); (3) sangramento, tremores, diarreia ou sinais de angústia são razões convincentes para um desfecho humano. De acordo com as diretrizes rigorosas da IACUC, o isoflurano seguido de luxação cervical é um bom desfecho. As taxas de sobrevida cirúrgica são de ~70% para um único dia (em comparação com ~40% para a cirurgia original de 2 dias), mas os pesquisadores não devem hesitar em terminar o experimento em um sinal de sofrimento. Isso deve ser levado em consideração ao planejar o número de animais.

Em termos de solução de problemas desta técnica, o sucesso da colocação da cânula linfática é o grande gargalo neste procedimento cirúrgico. Ao praticar a cirurgia, ajuda a gavagem do rato com 0,3 mL de azeite aproximadamente 2 h antes da cirurgia. Isso causará a secreção de quilomícrons no ducto linfático mesentérico, fazendo com que ele pareça "leitoso" e mais visível. O azul de metileno também pode ser usado, mas muitas vezes é menos óbvio do que o ducto linfático leitoso. Se após a colocação da cânula linfática e sua colocação com cola, a linfa mesentérica estiver fluindo com sucesso através da cânula para um vaso de coleta, então pode-se prosseguir com a colocação de um tubo de infusão duodenal. Ocasionalmente, a linfa pode não fluir continuamente, mas pode começar a fluir novamente quando o animal é colocado na mesa giratória. Criticamente, cuidado com coágulos dentro da tubulação linfática. Estes devem ser massageados para fora dos tubos para evitar a pressão de refluxo no ducto linfático.

Além da secreção de triglicerídeos e do fluxo linfático, esta técnica pode ser usada para determinar a seguinte cinética de absorção de lipídios e características quilomícrons:

Secreção de quilomícrons45,48,49
Imediatamente após uma refeição contendo gordura, há um aumento transitório nos triglicerídeos plasmáticos circulantes. Como os triglicerídeos são inerentemente hidrofóbicos, eles devem primeiro ser emulsionados para serem solúveis no sangue50. Os enterócitos do intestino delgado desempenham esse papel e embalam os triglicerídeos da dieta em partículas de emulsão de quilomícron51. Os quilomícrons contêm colesterol e triglicérides dietéticos em seu núcleo, cercados por fosfolipídios e apolipoproteínas, incluindo apoB-48, apoA-I, apoA-IV e apoC-III52,53,54,55. A ApoB-48 é a proteína estrutural essencial, e as outras apolipoproteínas têm várias funções necessárias para o metabolismo do quilomícron e a depuração do sangue. Para determinar as principais características dos quilomícrons, incluindo seu conteúdo de triglicérides e apolipoproteínas, a técnica de fístula linfática de 1 dia mostrada aqui deve ser usada. A taxa de secreção de quilomícrons é a porcentagem de 3H-triglicérides infundidos que são secretados na linfa e medidos por cintilação contando amostras de linfa de hora em hora. Isso pode ser combinado com a caracterização detalhada de quilomícrons 48,49,56,57,58. Amostras horárias de linfa podem ser combinadas ou mantidas separadamente. A linfa é transferida para tubos de ultracentrífuga, misturada com NaCl a 0,9% e, em seguida, cuidadosamente coberta com 300-500 μL de NaCl a 0,87%. As amostras são então ultracentrifugadas a 110.000 x g a 4 °C por 16 h. As frações superiores contendo quilomícrons isolados são coletadas e testadas para concentrações de triglicerídeos usando o kit de ensaio de triglicérides. Resumidamente, 2 μL do quilomícron (diluição 1:10) são incubados com 200 μL de reagente enzimático à temperatura ambiente por 10 min em uma placa de 96 poços. A placa é lida por um leitor de placas a 500 nm, e os padrões e blanks são usados para o cálculo das concentrações de triglicerídeos. O tamanho do quilomícron pode então ser determinado por coloração negativa e microscopia eletrônica de transmissão (MET)14,29. Triglicerídeos e colesterol podem ser quantificados por ensaio químico e conteúdo de apolipoproteínas (apoB-48, A-I, C-II, C-III) por kits de ELISA ou Western blot.

Determinação do sítio primário de absorção de lipídios 48,59
Ao isolar os compartimentos celulares luminal e epitelial do duodeno, jejuno e íleo 6 h após a infusão de 3 H-triglicérides ou de uma refeição mista radiomarcada, o conteúdo é extraído de Folch para determinar quanto dos 3H-triglicérides é absorvido através da membrana celular epitelial (normal) ou é retido no lúmen (anormal) ao longo do comprimento do intestino delgado48 . Esses estudos são particularmente impactantes se houver diferenças potenciais na motilidade gastrointestinal60,61,62, se houver uma hipótese em relação aos ácidos biliares (altamente ativos durante toda a absorção de lipídios e eles próprios reabsorvidos no íleo)63,64,65,66, ou se houver uma preocupação de que os nutrientes estejam sendo absorvidos no local anatômico errado (íleo ou mesmo cólon)67 68,69,70.

Identificação de mecanismos do tráfico de 3H-triglicerídeos para células epiteliais absortivas48
Isso é realizado calculando-se a porcentagem de 3 H-triglicérides hidrolisados para 3H-ácidos graxos livres no lúmen intestinal, absorvidos na mucosa e reesterificados em 3H-triglicérides intracelulares antes da secreção como quilomícrons. Este é um poderoso marcador de defeitos de absorção/secreção, uma vez que pode ser rastreado para mostrar o movimento de triglicerídeos dietéticos em seus produtos de degradação e subsequente embalagem em quilomícrons. A expressão de RNAm da maquinaria de absorção de ácidos graxos (CD36, FABPs, ACSLs), via de reesterificação (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) e apolipoproteínas (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) pode ser quantificada por RT-PCR.

Aplicações futuras desta técnica são limitadas apenas pelo interesse no crosstalk intestino-órgão, metabolismo, imunidade, absorção de nutrientes, contaminantes dietéticos ambientais, ou qualquer outra doença com um papel no sistema gastrointestinal. É provável que muitos experimentos e hipóteses convincentes tenham sido paralisados devido à dificuldade de acesso ao sistema linfático mesentérico crítico, e o objetivo deste protocolo visualizado é tornar essa técnica mais prontamente disponível. Isolar os quilomícrons e a linfa mesentérica na qual eles residem inicialmente é uma parte crítica da compreensão do metabolismo de corpo inteiro; O modelo de fístula linfática de camundongo de 1 dia é um poderoso modelo fisiológico para estudar esses eventos.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Somos extremamente gratos à Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, à ABK), à Rainin Foundation (Synergy Award, à PI GJ Randolph e à Co-I ABK) e ao National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 à ABK) pelo apoio a esses estudos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%, USP  estérilHospira, Lake Forest, IL, USNDC 0409-4888-06
Tubos Eppendorf de 1,7 mLFisher Scientific, Waltham, MA, US7200184
14C-colesterol: Colesterol-[4-14C] (0,1mCi/ mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, USARC 0857
Agulhade 18 GBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US305199
2 Fórceps de micro-dissecação DumontFine Science Tools, Foster City, CA, US11251-35
2 FórcepsROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5130
3H-TAG:  Trioleína [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/mL)American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, EUAART0199
3H-TG Trioleína [9,10-3H(N)] (3H-TG)American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  estérilHospira, Lake Forest, IL, USNDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: matriz de gel de sílica Z265500-1PAKFisher Scientific, Waltham, MA, US11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep SwabstickFisher Scientific, Waltham, MA, US14-910-501
Betadine esfoliante cirúrgicoDynarex Corp., Orangeburg, NY, US1201
Cânula de corte chanfradoBraintree Scientific.,  Braintree, MA, EUAMRE025
Buprenorfina HCl Injeção Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex)HenrySchein, Warrendale, PA, EUA1278184
C57BL6/J camundongos machosJackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrepBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA260100
Kit de Ensaio de ColesterolFujiFilm Healthcare, Lexington, MA, EUA
Colesterol-[4-14C]American Radiolabeled Chemicals, INC. St. LouisMO 63146
Caixa de plexiglass transparente L43cm X W26 X H 21 com almofada de aquecimento controlada por temperatura e umidificaçãonosso próprio design e modificações
disponíveis comercialmente  almofada de aquecimento para anfíbios/répteisShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, ChinaXHC-F035D
Aplicadores de ponta de algodãoFisher Scientific, Waltham, MA, US22363156
Tubo de infusão duodenal - canualaBraintree Scientific, Braintree, MA, USMRE037
GarantaAbbott Nutrition, Columbus, OH
Plataforma cirúrgica de almofada de aquecimento com combinação de bomba de água quente circulantePatterson Scientific, Waukesha, WI, USGaymar T/ Bomba de injeção clássica
hetarina sódica, USP 1.000 unidades/mL estérilMylan, Morgantown, WV, USNDC-67457-384-31
Image J SoftwareInstituto Nacional de Saúde, Bethesda, Maryland,
tesoura de írisROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
IsofluranoPiramal Pharma Solutions, Riverview, MI, USNDC 66794-017-25
Aparelho de indução de isoflurano e aparelho de anestesiaPatterson Scientific, Waukesha, WI, Câmaraindução de camundongo
Cola KrazyElmer's products Inc., Columbus, OH, EUAKG484
Liposyn III 20% injetável em lipídiosHospira Inc. Lake Forest, Illinois, EUA
LS 6500 Contador de cintilação multiusoBeckman Coulter, Brea, CA
Tesoura de mola micro-dissecanteROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5602
Kit ELISA apoB para mouseABCAM Inc., Waltham, MA, USab230932-1
Porta-agulhasFerramentas de ciências finas, Foster City, CA, US12002-12
AfastadoresKent Scientific Co., Torrington, CT, USSURGI-5001
Rimadyl (Carprofeno)Zoetis Inc., Kalamazoo MI, EUA4019449
Mesa giratória Barnstead ThermolyneLabquake, Zü rich, SuíçaBarnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipídio emulsão injetável, USPFresenius Kabi, Warrendale, PA, USNDC-63323-820-01
SnuggleLomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Î le-Perrot, QC J7V 7M4, CanadáMS 02.5PM
Tesoura CirúrgicaROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, USRS-5912SC
Sutura (5-0 seda com agulha)DemeTECH, Miami Lakes, FL, USDT-719
Microscópio Eletrônico de Transmissão (JEOL 1400-FLASH 120KV)JEOL, Peabody, MA
Kit de Ensaio de TriglicerídeosRandox Laboratories, Crumlin, Reino UnidoTR210
ULTIMA GOLD XR Fluido de CintilaçãoPerkin Elmer, Hebron, KY, EUA6013119
Ultracentrífuga, rotor S100AT4-497SORVALL RC M120 GX
99902601 de de dos EUA

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