Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio

Resumo

Relatamos aqui um protocolo para a quantificação e diferenciação de linfócitos B miocárdicos com base em sua localização no espaço intravascular ou endotelial utilizando citometria de fluxo.

Resumo

Um crescente corpo de evidências mostra que os linfócitos B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e da adaptação miocárdica à lesão. No entanto, a literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Foi relatado que as células B estão entre as células imunes mais prevalentes no coração do roedor ou estão presentes, mas com uma prevalência marcadamente menor do que as células mielóides, ou como sendo bastante raras. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado. A implementação de um método compartilhado e reprodutível para avaliar a prevalência de células B miocárdicas é fundamental para harmonizar as observações de diferentes grupos de pesquisa e, assim, promover o avanço do estudo das interações miocárdicas de células B. Com base em nossa experiência, as observações aparentemente contrastantes relatadas na literatura provavelmente decorrem do fato de que as células B miocárdicas murinas são principalmente intravasculares e conectadas ao endotélio microvascular. Portanto, o número de células B recuperadas de um coração murino é extremamente sensível às condições de perfusão usadas para limpar o órgão e ao método de digestão usado. Aqui relatamos um protocolo otimizado que leva em conta essas duas variáveis críticas de uma maneira específica. Este protocolo capacita a análise reprodutível, baseada em citometria de fluxo, do número de células B miocárdicas murinas e permite que os pesquisadores distingam células B miocárdicas extravasculares versus intravasculares.

Introdução

Os linfócitos B são células imunes altamente especializadas que desempenham um papel importante nas respostas imunes adaptativas e inatas¹. Existem duas populações principais de células B: uma população menor de células B1 que são produzidas principalmente durante a vida embrionária, e uma população preponderante de células B2 que são produzidas na vida adulta na medula óssea¹. Após a maturação na medula óssea, as células B migram para os órgãos linfoides primários e secundários. A partir daí, recirculam continuamente entre os órgãos linfoides que viajam através dos vasos sanguíneos e dos vasos linfáticos

Protocolo

Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados com a aprovação da IACUC da Johns Hopkins University School of Medicine.

1. Preparações

1. Prepare o buffer FACS, conforme descrito na Tabela 1.
2. Certifique-se de que há CO₂ suficiente para eutanasiar os animais.
3. Prepare o espaço de dissecação (coloque a almofada de bancada e coloque a fita adesiva e as ferramentas de dissecação nas proximidades).
4. Rotule os tubos de 15 ml, coloque 3 ml de HBSS com cálcio e magnésio em cada tubo (ver Tabela de Materiais) e coloque-os no gelo (um t....

Resultados

Uma vez concluída a aquisição e coletados todos os eventos, os dados devem ser analisados de acordo com a prática padrão de citometria de fluxo. O foco da análise irá variar dependendo do objetivo individual de cada experimento. Neste caso, a quantificação de células B intravasculares e extravasculares foi buscada, e foi expressa como o número de células por mg de tecido.

Ao usar um citômetro espectral, recomenda-se iniciar a análise com um bloqueio inicial para remover detritos com tamanhos q.......

Discussão

Um crescente corpo de evidências indica que as células B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e do remodelamento/adaptação miocárdica à lesão ^{7,8,9,10,11,12,13,36}. A citometria de fluxo é uma excelente ferramenta para estudar.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 700 anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo	101222	BioLegend	100 µ g 200 µ L
(CellTreat 29481) Filtro de Células, 40 µ m, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Tubo de Microcentrífuga Natural	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Injeção de Cloreto de Sódio, USP	114-055-101	Qualidade Biológica	0.90%
1.5 mL Tubo de Microcentrífuga Natural	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µ L Pontas de Filtro Graduadas TipOne	11213810	USA Scientific
1000 µ L Pontas de Filtro Graduadas TipOne	11267810	USA Scientific
Tubo de Centrífuga de 15 mL, Tampa de Vedação de Plugue, Polipropileno,	Válvula de Parada de	Livre
, Policarbonato	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoetanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µ L Pontas de Filtro TipOne Graduadas	11208810	da USA Scientific
, Policarbonato	SVPT953	ECT Manufacturing
Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL, estilo 12 x 75 mm	352054	Falcon, um
, Tampa de Vedação de Plugue, Polipropileno, Livre de RNase-/DNase	430290	Corning
ACK ( Tampão de Lise de Cloreto de Amônio-Potássio)	118-156-101	Qualidade	Osmolalidade Biológica: 290 + ou -5% mOsm/Kg Adaptador H20
4x50ml, para balde retangular de 250 mL no Rotor A-4-63	5810759005	Adaptador Eppendorf
para Tubos de Centrífuga de 15 mL, 9 Tubos por Adaptador, Fundo Cônico para uso com Modelo de Rotor A-4-62	22638289	Eppendorf
Adaptador para 15 tubos de fundo redondo 2.6 - ndash; 7 mL, para balde retangular de 250 mL em Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Folha de Alumínio 12 in x 75' Rolo .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Indução de Anestesia - Mouse	RWD-AICMV-100	de
com agulha anexada 25 G x 5/8 pol., estéril, uso único, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Seringas de Insulina Ultra-Fina Brandzig 29G 1cc 1/2" Pacote com 100 CMD	2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19	Anticorpo 115537	BioLegend	50 µ g/mL
CAPS para Tubos de Fluxo com malha de filtro 35 µ m, Posição dupla para tubos de 12 x 75 mm, estéril	T9009	Southern Labware
Dióxido de Carbono USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Copo de Forma Baixa, Vidro, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Colagenase 2	LS004176	Conector Sigma-Aldrich
latão cromado 1/4" fêmea NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Citômetro		de Fluxo Cytek Biosciences
Diss 1080 Mamilo 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet  3 - Controlador de pipeta eletrônico	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Centrífuga Eppendorf 5810R		Eppendorf Eppendorf
Research plus pipetas variáveis de		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, Ice Pan de densidade tripla (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hialuronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Reta	13018-14	Fine Science Tools
estéril, uso único, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderado	4033- CS150	McKesson
Navigator Balança Portátil Multiuso	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-camundongo/humano CD45R/B220 Anticorpo	103208	BioLegend	200 µ g/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-camundongo CD45 Anticorpo	103132	BioLegend	100 µ g 500 uL
Placa de Petri, Empilhável 35 mm x 10 mm Poliestireno Estéril	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Poderoso Iluminador LED de 6 Watts Duplo Pescoço de Ganso	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Agulha 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Rato purificado Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulador analítico de dois estágios entrega de 0-25 psi CGA320 Entrada de 3500 psi	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 baldes retangulares de 250 mL	Rotor A-4-62	Eppendorf
Pipeta sorológica, entupida, 10 mL, estéril, isento de pirogênios/endotoxinas, não citotóxico, 1 unid./blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Fita adesiva Co KG
Sigma	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Reto, Macho Luer Lock x 1/8" Mangueira Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Tamanho S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Seringa PP/PE sem agulha, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Bomba de seringa	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
TM10500	9371W13	Suporte
, 12  posições, 6 para 5.0  mL e 15  tubos de mL e 6 para 25  mL e 50  tubos mL, polipropileno, posições numeradas, autoclaváveis	30119835	Suporte para Tubos Eppendorf
, 12  posições, para 5.0  mL e 15  Tubos mL, polipropileno, posições numeradas, autoclaváveis	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
Pinça de Dissecção VWR com Pino Guia com Pontas Curvas	89259-946	Avantor, por VWR
Tesoura de Dissecação VWR, Ponta Afiada, 4½ "	82027-578	Avantor, da VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Modelo 3500I	12620-946	Avantor, da VWR
Zombie Aqua Kit de Viabilidade Fixável	423102	BioLegend

1 Via 430052 de RNase Válvula de Parada de 3 Vias Tubo de Centrífuga de 50 mL da Marca Corning Câmara de Seringa Ponta Deslizante BD Luer da Conduct Science 1 canal Seringa Luer Slip da Thomas Alarme Temporizador de 3 Canais para Tubos Thomas Scientific