Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Summary

Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.

Abstract

Pequenas vesículas extracelulares (sEV) podem ser liberadas de todos os tipos celulares e transportar proteínas, DNA e RNA. As moléculas sinalizadoras servem como indicadores do estado fisiológico e patológico de uma célula. No entanto, não há um método padrão para o isolamento de sEV, o que impede a identificação de biomarcadores a jusante e estudos de intervenção medicamentosa. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e purificação de sEV de 50-200 nm por um classificador de células de fluxo. Para isso, um bocal de 50 μm e uma pressão de fluido de bainha de 80 psi foram selecionados para obter uma boa taxa de classificação e fluxo lateral estável. Microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas para localizar populações de partículas de 100, 200 e 300 nm. Com a otimização adicional do limiar de disparo de tensão, ganho e dispersão direta (FSC), o sinal sEV pode ser separado do ruído de fundo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter uma população representativa de sEV usando FSC vs. dispersão lateral (SSC) somente. O método de isolamento baseado em citometria de fluxo não só permite a análise de alto rendimento, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de biomarcadores, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.

Introduction

Uma célula libera vesículas extracelulares (EVs) de tamanhos variados que resultam em moléculas sinalizadoras e inclusões de membrana, que são importantes para a comunicação intercelular¹. EVs de diferentes tamanhos também desempenham diferentes papéis biológicos, com 50-200 nm sEV sendo capaz de distribuir precisamente RNA, DNA e proteínas para o local extracelular correto. A EV também ajuda a determinar seus mecanismos de secreção, envolvendo não apenas a regulação de processos fisiológicos normais, como vigilância imunológica, manutenção de células-tronco, coagulação sanguínea e reparo tecidual, mas também a patologia subjacente a várias doe....

Protocol

1. Cultura celular

1. Preparar um meio de cultura de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Cultura de célula humana de câncer de pâncreas, PANC-1, em frasco de 75^cm2 a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL. Incubar a cultura a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Subcultivar as células quando a densidade celular atingir 75%-80% sob observação microscópica. Retire o meio e lave 2x com 3-5 mL de solução salina tampão fosfato (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Descarte a solução, adicione 1-2 mL de solução de tripsina-EDTA e deixe as células se destacarem até ficarem arr....

Results

O fluxograma do protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Neste método, microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas como padrões de referência para distribuição de tamanho de partículas. Sob a condição de parâmetro instrumental específico, o sinal de partícula pode ser claramente distinguido do ruído de fundo no gráfico FSC vs. SSC usando a forma logarítmica. As estratégias de gating são mostradas na Figura 2. R4, R5 e R6 referem-se às posiç.......

Discussion

Este protocolo descreve um método otimizado para isolar e purificar sEV com o tamanho de partícula especificado de 50-200 nm usando um classificador de células de fluxo, que foi validado por NTA. O método resolveu o problema do gargalo de obtenção de sEV com granulometria uniforme e alta pureza, evitando a interferência de moléculas biológicas não relacionadas envoltas em EVs de grande porte²². Análises rápidas e de alto rendimento são possíveis com a citometria de fluxo, que pode capturar 100.000.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de centrífuga	Beckman Coulter	344058
Frascos de cultura	Corning
Dulbecco' s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Soro bovino fetal	SUER	SUER050QY
Classificador de células Flow	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Célula de câncer pancreático humano, PANC-1	NA	NA AS	células PANC-1 foram doadas pelo Professor Weijun Yang, Faculdade de Ciências da Vida, Universidade de Zhejiang
Tamanho de partícula a laser e potencial zeta analisador	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Tampão fosfato salino Gibco		C20012500BT
Microesferas fluorescentes de poliestireno Microscopia	Beckman Coulter	6602336
	JEOL	JEM-1200EX
Solução de tripsina-EDTA	Gibco	1713949
Ultra partículas fluorescentes arco-íris	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Rotor de ultracentrífuga	Beckman Coulter	SW32TI