Artigo de método

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

DOI:

10.3791/64364

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24 de março de 2023

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1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

Neste artigo

Resumo

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Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Resumo

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Os cardiomiócitos derivados de células-tronco induzidas humanas (hiPSC-CMs) são usados para substituir e reduzir a dependência de animais e células animais para testes pré-clínicos de cardiotoxicidade. Em formatos bidimensionais de monocamada, os hiPSC-CMs recapitulam a estrutura e a função das células musculares cardíacas humanas adultas quando cultivadas em uma matriz extracelular (MEC) ótima. Uma MEC derivada de células-tronco perinatais humanas (matriz extracelular indutora de maturação-MECM) amadurece a estrutura, a função e o estado metabólico do hiPSC-CM em 7 dias após o plaqueamento.

As monocamadas maduras de hiPSC-CM também respondem, como esperado, a medicamentos clinicamente relevantes, com risco conhecido de causar arritmias e cardiotoxicidade. A maturação das monocamadas hiPSC-CM foi um obstáculo à adoção generalizada dessas células valiosas para a ciência regulatória e triagem de segurança, até agora. Este artigo apresenta métodos validados para o plaqueamento, maturação e fenotipagem funcional de alto rendimento da função eletrofisiológica e contrátil hiPSC-CM. Esses métodos aplicam-se aos cardiomiócitos purificados comercialmente disponíveis, bem como aos cardiomiócitos derivados de células-tronco gerados internamente usando protocolos de diferenciação altamente eficientes e específicos da câmara.

A função eletrofisiológica de alto rendimento é medida usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs; emissão: 488 nm), fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs) ou sensores de cálcio codificados geneticamente (GCaMP6). Um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento é usado para gravações ópticas de cada parâmetro funcional, e um software dedicado personalizado é usado para análise de dados eletrofisiológicos. Os protocolos MECM são aplicados para triagem de medicamentos usando um inotrópico positivo (isoprenaline) e bloqueadores de canal específicos do gene humano relacionado ao Ether-a-go-go (hERG). Esses recursos permitirão que outros pesquisadores utilizem com sucesso hiPSC-CMs maduros para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade de alto rendimento, testes de eficácia de medicamentos cardíacos e pesquisa cardiovascular.

Introdução

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Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (MC-hiPSC) foram validados em escala internacional e estão disponíveis para triagem de cardiotoxicidade in vitro 1. HiPSC-CMs altamente puros podem ser gerados em números virtualmente ilimitados, criopreservados e descongelados. Ao serem replaqueados, eles também reanimam e começam a se contrair com um ritmo que lembra o coração humano 2,3. Notavelmente, os hiPSC-CMs individuais se acoplam uns aos outros e formam sincícios funcionais que batem como um único tecido. Atualmente, as hiPSCs são rotineiramente derivadas de amostras de sangue de pacientes, de modo que qualquer pessoa pode ser representada usando ensaios in vitro de triagem de cardiotoxicidade com hiPSC-CM 4,5. Isso cria a oportunidade de realizar "Ensaios Clínicos em um Prato", com representação significativa de diversas populações6.

Uma vantagem crítica sobre as abordagens existentes de triagem de cardiotoxicidade animal e de células animais é que os hiPSC-CMs utilizam o genoma humano completo e oferecem um sistema in vitro com semelhanças genéticas com o coração humano. Isso é especialmente atraente para farmacogenômica e medicina personalizada - o uso de hiPSC-CMs para o desenvolvimento de medicamentos e outras terapias é previsto para fornecer prescrições de medicamentos mais precisas, precisas e seguras. De fato, ensaios bidimensionais (2D) de monocamada de hiPSC-CM provaram ser preditivos de cardiotoxicidade medicamentosa, utilizando um painel de medicamentos de uso clínico com risco conhecido de causar arritmias 1,7,8,9. Apesar do grande potencial dos MC-hiPSC e da promessa de agilizar e baratear o desenvolvimento de fármacos, tem havido uma relutância em utilizar esses novos ensaios10,11,12.

Até agora, uma grande limitação da ampla adoção e aceitação dos ensaios de rastreamento hiPSC-CM é sua aparência imatura e fetal, bem como sua função. A questão crítica da maturação da hiPSC-CM tem sido revista e debatida na literatura científica ad nauseum13,14,15,16. Da mesma forma, muitas abordagens têm sido empregadas para promover a maturação da hiPSC-CM, incluindo manipulações da matriz extracelular (MEC) em monocamadas 2D e o desenvolvimento de tecidos cardíacos (EHTs) projetados em 3D17,18. No momento, há uma crença amplamente difundida de que o uso de EHTs 3D proporcionará maturação superior em relação às abordagens baseadas em monocamadas 2D. No entanto, as monocamadas 2D proporcionam uma maior eficiência de utilização celular e maior sucesso no revestimento em comparação com os EHTs 3D; Os EHTs 3D utilizam um número maior de células e, muitas vezes, requerem a inclusão de outros tipos de células que podem confundir os resultados. Portanto, neste artigo, o foco está no uso de um método simples para amadurecer hiPSC-CMs cultivadas como monocamadas 2D de células acopladas elétrica e mecanicamente.

A maturação avançada do hiPSC-CM pode ser obtida em monocamadas 2D usando um ECM. As monocamadas 2D de hiPSC-CMs podem ser amadurecidas usando uma lamínula macia e flexível de polidimetilsiloxano, revestida com matriz de membrana basal secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo). Em 2016, relatos mostraram que os MC-hiPSC cultivados nessa condição de MEC mole amadureceram funcionalmente, exibindo velocidades de condução do potencial de ação próximas aos valores do coração adulto (~50 cm/s)18. Além disso, esses hiPSC-CMs maduros exibiram muitas outras características eletrofisiológicas que lembram o coração adulto, incluindo potencial de membrana de repouso hiperpolarizado e expressão de Kir2.1. Mais recentemente, relatos identificaram um revestimento de MEC derivado de células-tronco perinatais humanas que promove a maturação estrutural de HIPSC-CMs 2D19. Aqui, métodos fáceis de usar são apresentados para monocamadas hiPSC-CM 2D estruturalmente maduras para uso em telas eletrofisiológicas de alto rendimento. Além disso, fornecemos a validação de um instrumento de mapeamento óptico para a aquisição e análise automatizada da função eletrofisiológica da monocamada hiPSC-CM 2D, usando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e sondas e proteínas sensíveis ao cálcio.

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Protocolo

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O uso do hiPSC neste protocolo foi aprovado pelo Comitê HPSCRO da Universidade de Michigan (Comitê de Supervisão de Células-Tronco Pluripotentes Humanas). Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de materiais e equipamentos. Veja a Tabela 1 para mídias e suas composições.

1. Descongelamento e plaqueamento de hiPSC-CMs criopreservados comercialmente disponíveis para maturação em matriz extracelular indutora de maturação (MECM)

  1. Aquecer todos os reagentes à temperatura ambiente e reidratar as placas MECM com solução salina balanceada de Hank (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cálcio e magnésio, por 1 h antes do plaqueamento dos cardiomiócitos (200 μL de tampão por poço de uma placa de 96 poços).
  2. Lavar as placas MECM 2x com HBSS ou PBS contendo cálcio e magnésio por 1 h antes do plaqueamento dos cardiomiócitos (200 μL de tampão por poço de uma placa de 96 poços) e manter os poços hidratados.
  3. Prepare um banho-maria a 37 °C.
  4. Remova os tubos de cardiomiócitos do tanque de nitrogênio líquido, transfira os tubos para gelo seco e abra ligeiramente as tampas dos tubos para liberar pressão.
    OBS: Liberar pressão nos tubos é extremamente importante! Se muita pressão se acumular dentro dos tubos, eles podem explodir.
  5. Volte a selar as tampas dos tubos e coloque-as em banho-maria para descongelar durante 4 minutos.
    NOTA: Deixe-os descongelar completamente, para evitar danos celulares devido ao descongelamento parcial.
  6. Após o descongelamento das células, borrife os tubos com etanol 70% antes de abrir. Transfira as células para tubos cônicos de 15 mL com pipeta de 1 mL. Gotejar lentamente 8 mL de meio de plaqueamento, agitando o tubo cada vez que 1 mL for adicionado, para permitir que as células se ajustem às mudanças na osmolaridade.
    1. Lavar o criovial com 1 mL de meio de chapeamento usando uma pipeta de vidro de 1 mL. Em seguida, goteje lentamente a lavagem no tubo cônico de 15 mL.
  7. Centrifugar os tubos a ~300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de meio de plaqueamento. Remova uma alíquota e realize a contagem de células vivas com um hemocitômetro. Adicionar meio de plaqueamento adicional para obter 7,5 × 105 células/mL.
    NOTA: Aproximadamente 10 mL de suspensão celular são necessários para preparar 96 poços.
  8. Dispense 100 μL de suspensão celular por poço de uma placa de 96 poços revestida com MECM usando uma pipeta multicanal.
    NOTA: Certifique-se de evitar a precipitação celular e obter densidade celular uniforme em todos os poços durante o revestimento.
  9. Incubar as células a 37 °C, 5% CO 2 durante2 dias antes de mudar o meio para o meio de manutenção (200 μL/poço). Troque o meio de manutenção no dia 5 após o descongelamento. Realizar ensaios de EP no 7º dia ou mais tarde, conforme descrito anteriormente 8,9. Troque o meio a cada dois dias ao optar por estender a cultura celular.

2. diferenciação cardíaca hiPSC dirigida e purificação hiPSC-CM

  1. Solução quente de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) comercialmente disponível, HBSS sem cálcio e magnésio (HBSS--) e placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal solubilizada secretada por uma célula de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de camundongo) à temperatura ambiente.
  2. Marcar as colônias diferenciadas por microscopia de contraste de fase e aspirado/ablato. Lave bem cada poço com 1 mL de HBSS--. Realizar duas lavagens em poços contendo >10 pontos de diferenciação.
  3. Aspirar o HBSS -- e adicionar 1 mL de solução de EDTA a cada poço. Incubar as placas até 5 min a 37 °C. Verifique as placas após 3 min e procure colônias brancas translúcidas visíveis.
  4. Aspirar a solução de EDTA e adicionar 1 ml a um único poço. Deslocar as células com 2 mL de meio hiPSC pipetando a suspensão para cima e para baixo repetidamente, usando uma pipeta de vidro de 10 mL para separar todas as células-tronco do poço e transferir a suspensão celular para um tubo de coleta. Repita a aspiração e o deslocamento com poços subsequentes.
    OBS: Desalojar colônias difíceis de levantar com a ponta da pipeta de vidro.
  5. Conte as células-tronco e ajuste o volume para placa 8,0 × 105 células/poço. Cultivar as células em meio hiPSC (2 mL/poço) até que as células-tronco atinjam 90% de confluência (desta vez é referida doravante como D0).
  6. Preparar 2 mL de meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de CHIR99021.
  7. Em D0, lavar cada poço de uma placa de células-tronco de 6 poços com 1 mL de HBSS por poço. Substitua o HBSS por meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de CHIR99021.
  8. Em D1, não faça nada.
  9. Em D2, preparar meio de diferenciação basal suplementado com 4 μM de IWP4.
  10. Substitua o meio por 2 mL de meio de diferenciação basal suplementado com IWP4 por poço.
  11. Em D3, não faça nada para uma diferenciação ventricular-específica. Para uma diferenciação atrial-específica, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal suplementado com 4 μM de IWP4 e 1 μM de solução de ácido retinóico (AR) por poço.
  12. No D4, aspirar o meio e acrescentar 2 mL de meio basal por poço para diferenciação ventricular. Para uma diferenciação atrial, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal suplementado com 1 μM de solução de RA por poço.
  13. No D5, não faça nada.
  14. No D6, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio basal por poço (para diferenciação atrial e ventricular).
  15. No D7, não faça nada.
  16. No D8, aspirar o meio e adicionar 2 mL de meio de manutenção de cardiomiócitos. Mude o meio a cada dois dias até a separação celular, ou siga um plano de exposição crônica a drogas.

3. purificação hiPSC-CM via MACS (magnetic-activated cell sorting)

  1. Aspirar o meio de cultura celular e lavar bem cada um com 1 mL de HBSS--. Dissociar as células adicionando 1 mL de tripsina/EDTA a 0,25% e incubando a 37 °C, 5% CO2 por 10 min. Ressuspender e singularizar as células em cada poço com 2 mL de meio plaqueante para inativar a tripsina/EDTA.
  2. Coletar as células dos seis poços em um tubo cônico de 50 mL com filtro de 70 μm. Em seguida, lave o filtro com 3 mL de meio de chapeamento. Conte as células.
  3. Centrifugar a suspensão a ~300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e lavar as células com 20 mL de tampão de separação MACS gelado. Em seguida, centrifugar novamente a ~300 × g por 5 min.
  4. Ressuspender o pellet em 80 μL de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Adicionar 20 μL de cocktail frio de depleção de cardiomiócitos não cardiomiócitos (humano) por 5 × 106 células. Misture suavemente a suspensão celular e incube no gelo por 10 min.
  5. Lavar a amostra adicionando 4 ml de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Centrifugar a amostra a ~300 × g durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
  6. Ressuspender o pellet em 80 μL de tampão de separação MACS frio por 5 × 106 células. Adicionar 20 μL de microesferas frias anti-biotina por 5 × 106 células. Misture suavemente a suspensão celular e incube por 10 min no gelo.
  7. Enquanto as amostras estiverem incubando, coloque as colunas de depleção positiva (equipadas com os filtros de pré-separação de 30 μm) no separador MACS e coloque os tubos de coleta marcados de 15 mL abaixo das colunas. Uma coluna é necessária para cada 5 × 106 células.
  8. Primer cada coluna com 3 mL de tampão de separação MACS frio. Misturar a suspensão celular tratada com anticorpos com 2 ml de tampão de separação MACS por 5 × 106 células e adicionar à coluna.
    NOTA: Não centrifugar! A centrifugação nessa etapa tem efeitos prejudiciais sobre o rendimento dos cardiomiócitos.
  9. Adicionar 2 mL de tampão de separação MACS a cada coluna e coletar o fluxo até que 12 mL de suspensão de cardiomiócitos de fluxo sejam coletados.
    NOTA: Nunca deixe as colunas secarem totalmente.
  10. Centrifugar os cardiomiócitos a ~300 × g por 5 min, descartar o sobrenadante e suspender os cardiomiócitos em 1 mL de plaqueamento.
  11. Conte as células para determinar a concentração, ajuste o volume para a densidade de semeadura desejada e plaqueie as células. Plaquear os cardiomiócitos purificados nas placas MECM de 96 poços, conforme descrito acima nas etapas 1,9-1,11 (7,5 × 105 células/poço).

4. Mapeamento óptico utilizando corantes sensíveis à voltagem (VSDs) e fluoróforos sensíveis ao cálcio (CSFs)

  1. Preparar a quantidade adequada de CIV em HBSS com cálcio e magnésio, adicionando 1 μL de corante VSD por mL de HBSS e 10 μL de adjuvante de carga por mL de HBSS.
    NOTA: Normalmente, uma placa de 96 poços requer 10 mL de solução VSD.
  2. Alternativamente, preparar HBSS com cálcio e magnésio suplementado com 5 μM de LCR. Aspirar o meio de manutenção do cardiomiócito e substituir por 100 μL de CIV ou LCR por poço de uma placa de 96 poços. Incubar as células por 30 min na incubadora de cultura celular.
  3. Retire os corantes e substitua por meio de ensaio ou HBSS. Equilibre a 37 °C para a aquisição de mapeamento óptico de dados de linha de base com um dispositivo de mapeamento óptico de alto rendimento.
  4. Tratar as células com drogas para testes de exposição aguda, ou mapear as células que foram cronicamente expostas a drogas de interesse.
  5. Para testes de cardiotoxicidade em placas de 96 poços, use quatro doses de um composto com pelo menos seis poços por dose. Use doses que variam de abaixo a acima da concentração plasmática terapêutica efetiva, incluindo uma dose da concentração plasmática terapêutica clinicamente eficaz.
  6. Diluir os fármacos em dimetil sulfóxido, armazená-los como soluções-estoque a -20 °C e, em seguida, diluí-los em HBSS para as concentrações desejadas.
  7. Faça medições eletrofisiológicas basais antes da aplicação do medicamento, conforme descrito na seção 5. Uma vez que as drogas tenham sido aplicadas, faça registros eletrofisiológicos pelo menos 30 minutos depois para estudos crônicos. Consulte as seções a seguir para obter procedimentos de aquisição e análise de dados de mapeamento óptico.

5. Mapeamento óptico utilizando indicador de cálcio codificado geneticamente (GECI)

  1. Placas hiPSC-CMs comercialmente disponíveis ou purificadas por MACS, como descrito acima, usando placas de 96 poços revestidas com MECM para fazer hiPSC-CMs maduros. Para formar monocamadas confluentes, placa de 7,5 × 104 CMs por poço de cada placa de 96 poços. Use meio de chapeamento.
  2. Após 48 h em meio de plaqueamento, mude para meio de manutenção de cardiomiócitos.
  3. No dia 4 após o descongelamento e replaqueamento, adicionar adenovírus recombinante para expressar GCaMP6m (AdGCaMP6m) às células em uma multiplicidade de infecção (MOI) = 5. Adicione o vírus usando o meio de ensaio CM.
    NOTA: Aqui, experimentos usando GCaMP6m foram realizados em cardiomiócitos iCell2 de um fornecedor comercial.
  4. No dia 5, remova o meio adGCaMP6m e substitua por RPMI+B27 fresco (meio de manutenção de cardiomiócitos).
  5. No 7º dia, observar os MCs por meio de microscopia ou do imageador de mapeamento óptico, para visualizar as contrações espontâneas e os transientes de cálcio correspondentes.
  6. No dia 7 ou mais tarde, para triagem medicamentosa, transfira diretamente placas de 96 poços de monocamadas hiPSC-CM maduras expressando GCaMP6m para o imageador de mapeamento óptico da incubadora para aquisição dos dados basais.
  7. Após a aquisição dos dados eletrofisiológicos, retornar as placas dos MCs à incubadora de cultura de tecidos, para medidas em um ponto de tempo subsequente.
  8. Após os registros basais, aplicar os medicamentos, utilizando pelo menos quatro doses de cada medicamento e pelo menos seis poços por dose. Equilibre os medicamentos nas células por pelo menos 30 minutos antes da coleta de dados. Aqueça a temperatura do poço a ~37 °C antes e durante a aquisição de dados.
  9. Após os registros basais de uma placa inteira, adicione isoproterenol (500 nM) a cada poço para permitir dados robustos de resposta a medicamentos. Quantificar os efeitos do isoproterenol na taxa de batimento da monocamada, na amplitude da contração (amplitude transitória do cálcio) e na duração do transiente do cálcio (ver Figura 6), conforme descrito na secção 5.

6. Aquisição de dados e análises de mapeamento óptico

  1. Verifique se a câmera, o transiluminador e o aquecedor de placas do dispositivo de mapeamento óptico estão ligados.
  2. Abra o software de aquisição e determine o local de salvamento do arquivo.
  3. Abra a gaveta frontal e posicione a placa no aquecedor de placas.
  4. Adquira uma moldura escura clicando no botão Moldura escura .
  5. Selecione Duração (10-30 s) e Taxa de quadros de aquisição (por exemplo, 100 fps; 250 fps para maior resolução temporal) e clique em Iniciar aquisição.
  6. Abra o software de análise e, na guia Importar/Filtrar , selecione Procurar um único arquivo ou Múltiplo de bloco para reconstruir uma placa.
  7. Selecione Modo de parâmetro (APD ou CaTD), insira Distância por pixel e use o Assistente de poço para determinar a localização dos poços na imagem. Clique em Processar Salvar para ir para a próxima guia.
  8. Abra a guia ROIs (regiões de interesse) e escolha desenhar as ROIs manualmente, automaticamente ou não usar ROIs, o que consideraria todo o poço para análise. Depois que as ROIs tiverem sido selecionadas, clique no botão Processar/Salvar para passar para a próxima etapa. Marque as caixas Ocultar poços e Mostrar somente filtrado para visualizar as ROIs.
  9. Abra a guia Análise e, no canto superior direito da tela, selecione cada Poço ou ROI para confirmar a Precisão da Detecção Automática de Batidas. Adicione ou remova batidas dos rastreamentos pressionando Add Beat/ Save Beats, ou selecionando uma batida individual e pressionando Delete no teclado.
  10. Opcionalmente, use o recurso Mapas de calor médio para criar mapas de calor dos parâmetros selecionados para a placa.
  11. Clique no botão Gráfico de Espaço-Tempo na guia Análise para visualizar os dados de cada poço ou o ROI. Depois de certificar-se de que a detecção de batida é precisa, vá para a guia Exportar e selecione Formato de arquivo. Pressione Exportar e crie uma pasta para a qual os dados serão exportados. Prossiga para abrir arquivos de dados e execute a rotina de análise estatística escolhida.
    Observação : arquivos .xlxs são preferidos como todos os parâmetros são exportados em um único arquivo; Outros formatos (.csv ou .tsv) geram um arquivo por parâmetro.

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Resultados

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Maturação hiPSC-CM caracterizada por contraste de fase e imagem confocal imunofluorescente
A linha do tempo para a maturação mediada por MEC de hiPSC-CMs comercialmente disponíveis usando placas de 96 poços revestidas com MECM é apresentada na Figura 1A. Esses dados são coletados usando cardiomiócitos disponíveis comercialmente que chegam ao laboratório como frascos criopreservados de células. Cada frasco para injetáveis contém >5 × 106 cardiomiócitos viávei...

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Discussão

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Existem várias abordagens diferentes para a triagem de cardiotoxicidade in vitro usando hiPSC-CMs. Um recente artigo de "Melhores Práticas" sobre o uso de hiPSC-CMs apresentou os vários ensaios in vitro , suas leituras primárias e, principalmente, a granularidade de cada ensaio para quantificar a função eletrofisiológica cardíaca humana20. Além de usar eletrodos perfurantes de membrana, a medida mais direta da função eletrofisiológica cardíaca humana é fornecida pelas CIVs. As le...

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Divulgações

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TJH é consultor e conselheiro científico da StemBioSys, Inc.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH HL148068-04 e R44ES027703-02 (TJH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina EDTAGibco25200-056
0,5 mg/mL BSA (7,5 µ mol/L)Millipore SigmaA3294
2,9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumina humanaSigmaA9731-1G
anticorpo alfa actininaThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbitatinaSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Meio de ensaio transparente (fluorobrite)ThermoFisherA1896701para adenovírus transdução
DAPIThermoFisher62248
DMEM: F12Gibco11330-032
FBS (soro bovino fetal)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM mídia de manutençãoFUJIFILM / Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratoSigmaA8960-5g
L-glutaminaGibcoA2916801
colunas LSMiltenyii Biotec130-042-401
Buffer MACS (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R
Gibco11140-050
Miltenyii Biotec130-041-407
Kit de isolamento de cardiomiócitos derivado de PSC, humanoMiltenyii Biotec130-110-188
Separadorhttps://www.curibio.com/products-overview Pulse CuriBio
(Ímã)Miltenyii Biotec130-091-051
Ácido RetinóicoSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamina)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI anticorpo (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ácido etilenodiaminotetracético - solução de EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 dicloridratoTocris1254
β-mercaptoetanolGibco21985023
Microscópio Confocal Aminoácidos não essenciais Nikon Filtro de pré-separação MACS Quadro

Referências

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  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
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  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
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