Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Summary

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Abstract

A Neurogênese do Hipocampo Adulto (AHN), que consiste em uma manutenção ao longo da vida de células-tronco neurais proliferativas e quiescentes (NSCs) dentro da zona subgranular (SGZ) do giro dentado (DG) e sua diferenciação de neurônios recém-nascidos em células de grânulos na camada de células granuladas, é bem validada em numerosos estudos. O uso de animais geneticamente modificados, particularmente roedores, é uma ferramenta valiosa para investigar as vias de sinalização que regulam a AHN e estudar o papel de cada tipo de célula que compõe o nicho neurogênico do hipocampo. Para abordar este último, os métodos que combinam o isolamento de núcleos únicos com o sequenciamento de próxima geração tiveram um impacto significativo no campo da AHN para identificar assinaturas gênicas para cada população celular. No entanto, é necessário um maior refinamento dessas técnicas para traçar fenotipicamente o perfil de populações celulares mais raras dentro do GD. Aqui, apresentamos um método que utiliza a Classificação de Núcleos Ativados por Fluorescência (FANS) para excluir a maioria das populações neuronais de uma única suspensão de núcleos isolada de DG recém-dissecado, selecionando núcleos não corados para o antígeno NeuN, a fim de realizar o sequenciamento de RNA de núcleos únicos (snRNA-seq). Este método é um potencial trampolim para investigar ainda mais a regulação intercelular do AHN e descobrir novos marcadores e mecanismos celulares entre as espécies.

Introduction

A geração contínua de neurônios hipocampais na idade adulta, também conhecida como Neurogênese do Hipocampo Adulto (AHN), está associada a funções cognitivas como aprendizagem, aquisição/depuração da memória e separação de padrões e parece ser um importante mecanismo de resiliência no envelhecimento e doenças neurodegenerativas para prevenir déficits cognitivos ^1,2,3 . Os roedores têm sido o modelo de escolha para estudar a AHN usando vários métodos, incluindo imunocitoquímica e métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS). A tradução desses resultados para outras espécies permanece controversa. De fato, a AHN tem sido observada na maioria das espécies, mas a extensão em que ela persiste ao longo da vida, particularmente em humanos 4,5,6,7,8, é regularmente debatida.

Até o momento, várias vias de sinalização intrínsecas e extrínsecas foram confirmadas para modular o AHN¹. No entanto, o impacto da comunicação intercelular na AHN está apenas emergindo⁹. Isso pode ser atribuído em primeiro lugar à especificidade insuficiente dos marcadores celulares atualmente conhecidos para realizar análises in vivo com animais geneticamente modificados. De fato, muitos estudos se basearam em marcadores como a doublecortina ou a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) que são expressos em vários tipos celulares¹. Em segundo lugar, a complexidade e o alto grau de diversidade celular no nicho hipocampal adulto¹⁰ trazem desafios técnicos para o perfil de cada tipo de célula. Este é particularmente o caso da análise bioinformática com marcadores celulares sobrepostos utilizados em pipelines analíticos para diferentes populações, como NSCs ou células gliais, resultando em conclusões controversas ao avaliar a AHN ^7,11. Em terceiro lugar, o grande número de neurônios prejudica a investigação de populações celulares menos abundantes, como astrócitos, oligodendrócitos ou células ependimárias, embora seu papel na regulação do ajuste fino da AHN esteja se tornando proeminente⁹. Juntas, essas limitações afetam a capacidade de traduzir resultados de roedores para outras espécies. Isso é particularmente amplificado pela dificuldade de recapitular in vitro um tecido complexo, como o nicho neurogênico hipocampal, e pelos muitos obstáculos de acesso a tecidos de alta qualidade, juntamente com a falta de protocolos padronizados para o processamento tecidual em estudos envolvendo tecidos humanos^12,13. Portanto, é fundamental desenvolver novas abordagens para traçar o perfil das populações celulares e identificar novos marcadores celulares dentro do giro dentado (GD) que, em última análise, levarão a uma melhor compreensão das diferentes contribuições de cada tipo de célula para a regulação do AHN.

Para conseguir isso, o isolamento de célula única (sc) e núcleos únicos (sn) combinado com o sequenciamento de RNA tornou-se instrumental para investigar tecidos complexos, como o DG¹⁴. Dessa forma, estratégias de enriquecimento celular para isolar células isoladas do nicho hipocampal adulto de camundongos têm sido realizadas principalmente para examinar NSCs^15,16. Uma estratégia interessante para enriquecer células não neuronais do GD foi aplicada pelo sequenciamento de células simples duplamente negativas GluR1/Cd24 que resultou em 1.408 células sendo sequenciadas sem aglomerados distintos entre astrócitos e NSCs após análise bioinformática¹⁷. Isso pode ser devido à digestão enzimática severa necessária para a preparação de uma única célula que danifica a integridade celular e o RNA. Para contornar essa questão técnica, vários métodos que utilizam o isolamento de núcleos únicos têm sido desenvolvidos e são particularmente adequados para tecidos intrincados^11,18. No entanto, a predominância de neurônios dentro do GD ou, mais amplamente, dentro do sistema hipocampal-entorrinal gera um viés de amostragem para estudar a totalidade das populações celulares presentes nessas áreas cerebrais. Além disso, o número limitado de células a serem carregadas para a preparação de bibliotecas de células únicas acentua a presença da maior população celular em pipelines analíticos de núcleos únicos sequenciados. De fato, grandes aglomerados neuronais são frequentemente anotados e analisados, enquanto outras populações celulares estão sendo sub-representadas ou perdidas ^5,11.

Na tentativa de superar esses vieses e ser capaz de traçar o perfil de outros tipos celulares que não os neurônios presentes no GD do camundongo, um método foi desenvolvido neste estudo utilizando o princípio da Classificação de Núcleos Ativados por Fluorescência (FANS)¹⁸ que exclui a maioria das populações neuronais pela seleção negativa de núcleos únicos corados com antígeno nuclear neuronal (NeuN, também conhecido como Rbfox3). Essa escolha do antígeno foi orientada pela literatura que descreve a NeuN como um marcador neuronal confiável¹⁹ e pela necessidade de utilização de uma proteína nuclear para essa abordagem. Células classificadas com FACS NeuN-negativas foram então preparadas para sequenciamento de RNA em uma plataforma 10x Genomics. Os resultados demonstram que a exclusão de células que expressam NeuN permite um perfil transcriptômico específico do tipo celular e de alta qualidade de populações celulares gliais e raras.

Protocol

Cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Francis Crick, bem como as diretrizes e leis do Ministério do Interior do Reino Unido.

Figura 1: Preparação de uma suspensão de núcleos únicos a partir do GD dissecado de camundongos adultos para snRNA-seq de populações não neuronais. Diagrama de fluxo descrevendo as principais etapas do protocolo que incluem dissecção de DG de camundongo, preparação de uma suspensão de núcleos únicos, imunocoloração de NeuN e classificação negativa de NeuN-FANS antes de prosseguir com snRNA-seq. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Dissecação da DG (Calendário: 15 min)

1. Preparar os meios de isolamento dos núcleos 1 e 2 (NIM1 e NIM2), tampão de homogeneização (HB) e meio de lavagem (WM) (Tabela Suplementar 1). Coloque todos os tampões, meios, reagentes e ferramentas no gelo até que seja necessário. Coloque o homogeneizador Dounce (ver Tabela de Materiais) no gelo durante a preparação (mínimo de 1 h antes da etapa de homogeneização).
   NOTA: NIM1 pode ser preparado e armazenado a 4 °C por até 6 meses. NIM2, HB e WM devem ser preparados recentemente.
   CUIDADO: Manipule a TDT, o inibidor de protease e o Triton X-100 com cuidado. Estes compostos são irritantes para a pele e os olhos, agudamente tóxicos e perigosos para o ambiente aquático. Ao usar esses produtos químicos, use luvas de proteção, roupas, proteção para os olhos e o rosto, lave bem as mãos após o manuseio e evite a liberação para o meio ambiente.
2. Eutanasiar um rato C57Bl/6J macho de 22 meses de idade por luxação cervical após o procedimento Home Office Schedule 1²⁰.
   NOTA: Veja a discussão para fundamentação sobre o uso de rato de 22 meses de idade neste estudo. No entanto, este protocolo pode ser realizado em qualquer idade ao longo da vida.
3. Dissecar o cérebro de um rato eutanasiado e transferi-lo para uma placa de Petri de 10 cm cheia de PBS gelado 1x (Figura 1). Coloque a placa de Petri no gelo. Remova o cerebelo usando um bisturi e corte o cérebro ao meio entre os dois hemisférios (ao longo do eixo sagital).
4. Preencha uma nova placa de Petri de 10 cm com PBS gelado e coloque-a no gelo. Transfira metade do cérebro para a nova placa de Petri. Usando binóculos, disseque o GD e repita este passo para obter o segundo DG da segunda metade do cérebro.
   NOTA: Essas etapas (etapas 1.2-1.4) foram adaptadas de um procedimento descrito anteriormente²¹. É importante proceder o mais rapidamente possível nesta fase para preservar a integridade das células.
5. Transfira os dois GDs para o homogeneizador Dounce pré-resfriado e adicione 1 mL de HB frio.

2. Dissociação tecidual, isolamento de núcleos únicos e imunocoloração anti-NeuN (Tempo: 2 h)

1. Homogeneize o tecido com 10 golpes do pilão "A" solto, seguido por 15 traços do pilão "B" apertado.
   NOTA: A homogeneização do salto deve ser realizada com a argamassa sobre gelo com movimentos suaves para reduzir o calor causado pelo atrito e formação de espuma. Todos os tampões e equipamentos devem ser pré-resfriados e mantidos no gelo durante o procedimento.
2. Transfira o homogeneizado para um tubo pré-resfriado de 15 mL; enxaguar o homogeneizador Dounce com 1 mL de HB frio e combinar com o mesmo tubo. Adicione 3 mL de HB ao tubo de 15 mL e incube 5 min no gelo. Misture 2x invertendo o tubo suavemente.
3. Pré-molhado uma tampa de filtro de 70 μm com 0,5 mL de HB sobre um tubo de ensaio de 50 mL. Coe a suspensão dos núcleos a partir da etapa 2.2 inclinando-se sobre o tubo de 15 mL suavemente no filtro celular. Lave o filtro celular com 0,5 mL de HB.
4. Remover o filtro de células e centrifugar o tubo de ensaio a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C, utilizando uma centrífuga de balde oscilante. Descarte o sobrenadante.
   NOTA: Forçar o homogeneizado ajudará a reduzir os detritos, o que é crítico para a citometria de fluxo e as etapas a jusante do snRNA-seq.
5. Ressuscite o pellet suavemente em 4 mL de HB usando uma pipeta P1000. Incubar no gelo por 5 min. Gire a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de WM.
6. Pré-molhado uma tampa de filtro de 35 μm sobre um tubo de ensaio de 15 mL com 0,5 mL de WM. Coe a suspensão dos núcleos da etapa 2,5 através do filtro celular, pipetando suavemente 0,5 mL de cada vez usando uma pipeta P1000.
7. Lave a tampa do filtro com 0,5 mL de WM e coloque o tubo no gelo. Transferir o filtrado para um novo tubo de 15 ml e centrífuga durante 5 min e 4 °C a 500 x g. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de WM.
8. Gire a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de WM com o anticorpo conjugado com NeuN, Alexa Fluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) e 1 μg/mL de DAPI. Incube por 45 min no gelo no escuro.
   NOTA: Para otimizar a imunocoloração de núcleos isolados, recomenda-se titular o anticorpo para determinar a diluição ideal para análise e classificação por citometria de fluxo. Em seguida, execute controles adequados para confirmar que as condições de coloração são ideais. Por exemplo, com o anticorpo conjugado anti-NeuN-AF488, um controle negativo (ou seja, sem adição do anticorpo, Figura 1A Suplementar) e um controle positivo (ou seja, coloração com o anticorpo, Figura 1B Suplementar) foram executados para avaliar a segregação de populações não coradas e coradas. Ao começar a trabalhar com um anticorpo conjugado com AF488, recomenda-se a execução de um controle de isotipo conjugado com AF488 para avaliar a especificidade. Se um anticorpo não conjugado for usado, o controle adicional, como a adição de um anticorpo secundário apenas a uma preparação de núcleos, pode ser necessário para avaliar a ligação inespecífica do anticorpo secundário.

3. Classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS) para excluir populações neuronais (Tempo: 45 min)

1. Transfira a suspensão de núcleos imunocorados para um tubo de ensaio de 5 mL e mantenha-a no gelo até o início do procedimento de citometria de fluxo.
   NOTA: Se trabalhar com pedaços de tecido maiores do que dois DG de rato, poderá ser necessária uma diluição adicional com tampão WM para evitar o entupimento do FACS se a densidade dos núcleos na solução se tornar elevada.
2. Vórtice as amostras por 3 s a baixa velocidade antes de colocar os tubos no instrumento FACS (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: (Configuração FACS) As máquinas de classificação precisam ser alinhadas no início do procedimento com partículas de calibração seguindo as recomendações do fabricante. O atraso da queda foi calibrado com contas ou microesferas (ver Tabela de Materiais) de acordo com o modelo FACS. As amostras foram classificadas a 4 °C no modo de pureza. Para reduzir o volume de coleta, os núcleos foram classificados através de um bocal de 70 μm à pressão recomendada para o citômetro de fluxo. Os núcleos foram classificados em tubos de baixa ligação de 1,5 mL (ver Tabela de Materiais) contendo 50 μL de WM. Todos os tubos de coleta foram revestidos em PBS + BSA a 5% a 4 °C durante a noite para reduzir o risco de aderência dos núcleos às paredes do tubo.
3. Para adquirir os dados de uma amostra da suspensão dos núcleos corados, defina as portas em altura DAPI e área DAPI, a fim de excluir os detritos celulares e os núcleos agregados (Figura 2A). Além disso, separe núcleos únicos de quaisquer agregados ou detritos celulares corados por DAPI restantes, definindo as portas na área de dispersão lateral (SSC) e na área de dispersão direta (FCS) (Figura 2B).
4. Defina as portas para o anti-NeuN-AF488 e a área FSC, para isolar a população negativa de NeuN-AF488, como mostra a Figura 2C.
5. Após análise, utilizando a estratégia de gating descrita acima, classifique a população negativa de NeuN-AF488 em um tubo de coleta de 1,5 mL preenchido com 50 μL de WM.
   NOTA: Seguindo a estratégia de bloqueio descrita acima e o procedimento de dissecção para isolar o DG do cérebro de um rato adulto, espera-se que a população NeuN-AF488-negativa represente ~14% dos núcleos únicos.

Figura 2: Isolamento e perfil transcriptômico de populações celulares não neuronais da estratégia de Gating DG. (A-C) para isolar núcleos únicos negativos para NeuN-AF488 e excluir detritos celulares. (A) Gráfico de pontos FANS de uma amostra representativa de núcleos isolados, representando a configuração da porta para a seleção de núcleos DAPI+ e exclusão de detritos celulares e agregados. (B) Seleção adicional de núcleos únicos relevantes usando a área FSC e a área SSC. (C) As portas para NeuN-AF488 para excluir a população positiva e classificar para os núcleos únicos negativos. (D) Micrografia de uma boa suspensão de núcleos únicos com quantidade mínima de detritos e maior proporção de núcleos de boa qualidade (forma redonda, seta preta) em comparação com núcleos de má qualidade (seta branca). Barras de escala = 50 μm, 10 μm (inserção). (E,F) Análise de dados de snRNA-seq e perfil das populações celulares distintas isoladas do GD de camundongos machos C57BL/6J de 22 meses de idade. Gráficos UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) de perfis de núcleos únicos das células (E) não classificadas pelo FACS e (F) células classificadas por FACS NeuN-negativas, coloridas por tipo de célula. (G) Gráficos de pizza comparando as frequências dos tipos de células identificados em ambas as amostras. (H) Respectivas métricas para as amostras sequenciadas: número de núcleos, número mediano de genes e transcritos por núcleo. (I) Gráficos para violino mostrando a distribuição do número de genes e transcritos detectados para cada tipo de célula em ambas as amostras. Astr. = astrócitos, Olig. = oligodendrócitos, Vasc. = células vasculares, CRCs = células de Cajal-Retzius, Neur. = neurônios, Imm. = células imunitárias, OPCs = células precursoras de oligodendrócitos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Preparação da suspensão de núcleos únicos para realizar o sequenciamento de RNA de núcleos únicos (Tempo: 30 min)

1. Após a triagem, adicionar 1 mL de PBS contendo 1% de BSA ao tubo de coleta para coletar gotículas na parede do tubo e girar a 500 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante, deixando 50 μL.
   NOTA: Manuseie os núcleos centrifugados com cuidado, pois pode ser difícil observar qualquer pellet no fundo do tubo. O uso de uma centrífuga de balde oscilante ajudará a descartar o sobrenadante sem interromper o pellet.
2. Pipetar suavemente para ressuspender núcleos centrifugados. Adicionar 5 μL da suspensão de núcleos a 5 μL de azul de tripano num microtubo de 0,5 ml.
   CUIDADO: Manuseie o azul de tripano com cuidado, pois é perigoso para a saúde, pode causar câncer e é suspeito de prejudicar a fertilidade ou o feto. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos e rostos. Não manuseie até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas.
3. Medir a concentração e avaliar a viabilidade da suspensão de célula única utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado (ver Tabela de Materiais). Realize a preparação da biblioteca e o sequenciamento dos núcleos, conforme detalhado na etapa 5.
   NOTA: As amostras consideradas de boa qualidade para sequenciamento apresentaram forma de núcleos redondos e regulares ao microscópio, sem detritos celulares (Figura 2D). A presença de um halo ao redor da membrana nuclear ou a agregação de múltiplos núcleos juntos são sinais de núcleos danificados e tais suspensões celulares não devem ser consideradas para snRNA-seq (Figura 2D). A concentração medida de núcleos estava dentro da faixa de 300-700 núcleos/μL.

5. Preparação e sequenciamento da biblioteca

NOTA: A descrição das etapas a seguir é baseada na plataforma de sequenciamento interna usada neste estudo (consulte Tabela de Materiais). Portanto, algumas configurações podem diferir ao usar uma plataforma diferente. Aqui, apenas as principais etapas são descritas e cada parâmetro deve ser determinado seguindo as orientações e protocolos do fabricante escolhido, embora com otimização antes do primeiro uso. É fundamental garantir que a preparação das bibliotecas seja realizada o mais rápido possível após a concentração das suspensões de núcleos classificados para evitar a degradação do RNA e garantir a qualidade ideal do sequenciamento.

1. Carregue entre 7.000 e 10.000 núcleos em um chip de célula única microfluídico.
2. Particionar núcleos carregados em gotículas em escala nanolitro usando o controlador fornecido e os reagentes do fornecedor escolhido. Lisar núcleos dentro de cada gota e transcrever RNA reverso.
   NOTA: Dentro de uma gota, todo o cDNA resultante compartilhava o mesmo código de barras celular.
3. Prepare bibliotecas para snRNA-seq seguindo as diretrizes do fornecedor escolhido e garantindo a compatibilidade com a plataforma de sequenciamento. Verifique a qualidade e a concentração das bibliotecas finais usando eletroforese, fluorometria ou métodos baseados em qPCR e, se aplicável, agrupe-as equimolarmente antes do sequenciamento.
4. A Denature reuniu bibliotecas de expressão gênica 3¹ e diluiu de acordo com a recomendação do fabricante.
5. Execute o sequenciamento de indexação emparelhada, única ou dupla em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração com profundidade de sequenciamento de 50.000 pares de leitura por célula.

Results

O protocolo aqui apresentado descreve um método para preparar uma suspensão de núcleos únicos não neuronais isolados do GD para realizar snRNA-seq. Com ou sem FANS, o agrupamento bioinformático revelou grupos bem separados de núcleos correspondentes a tipos celulares conhecidos dentro do GD (Figura 2E,F). Dentro da amostra não classificada pelo FACS, a maioria dos núcleos de alta qualidade que foram sequenciados compreendeu três grupos de neurônios (84,9% do total de núcleos para esta amostra, Figura 2E,G,H). Tais resultados são esperados, considerando que as populações celulares mais representadas no GD são neurônios granulados, outros neurônios excitatórios (neurônios excitatórios marcados) e neurônios inibitórios¹⁰. Os aglomerados não neuronais identificados foram constituídos maioritariamente por tipos de células gliais (11,1%), incluindo astrócitos, oligodendrócitos e células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), células imunitárias (3,3%) e células de Cajal-Retzius (0,6%). Ao realizar FANS para excluir populações positivas de NeuN (amostra classificada por FACS NeuN-negativo; Figura 2F,G,H), os aglomerados de células gliais tornaram-se predominantes (81,3%). O isolamento de um maior número de núcleos gliais permite uma melhor segmentação de diferentes populações que se agrupariam sem o FANS. De fato, ao reagrupar e analisar genes específicos expressos em NSCs ou em astrócitos, quatro subaglomerados se separaram (Figura suplementar 2A,B). Observando marcadores celulares mais específicos e avaliando os níveis de expressão gênica entre os tipos celulares, um pequeno aglomerado de NSCs foi detectado segregando separadamente das principais populações astrocíticas com maior expressão de Hopx e Notch2 e quase nenhuma expressão de Aldh1a1 ou Aqp4 (Figura suplementar 2C). No entanto, devido à sobreposição na expressão gênica entre astrócitos e NSCs, uma análise mais aprofundada seria necessária para traçar especificamente o perfil e identificar diferentes subtipos de células. Além disso, a amostra de FANS NeuN-negativos teve clusters adicionais marcados como células vasculares (2,3%) que abrangem células endoteliais, pericitos e células leptomeníngeas vasculares quando cruzadas para expressão de marcadores específicos celulares (dados não mostrados).

Seguindo as orientações para o protocolo escolhido para gerar bibliotecas para sequenciamento, perfis de expressão de alta qualidade foram obtidos com ou sem FANS. Para amostras sequenciadas a 50.000 leituras/núcleo, foram detectados, em média, 2.510 genes por núcleos para a amostra não classificada por FACS (5.578 transcritos, Figura 2H) e 1.665,5 genes (3.508 transcritos) para a amostra FANS NeuN-negativa, após filtragem de núcleos de baixa qualidade (Figura 2H,I). Essas métricas confirmam que esse protocolo gera um perfil transcriptômico de alta qualidade de núcleos únicos comparável a estudos que utilizam diferentes abordagens^22,23 e que o processo de classificação do FACS não danifica os núcleos para o snRNA-seq subsequente. Notavelmente, a diferença no número de genes e transcritos por núcleos entre as duas amostras não se deve à menor qualidade dos dados, mas à alta proporção de neurônios na amostra não classificada pelo FACS (84,9% em comparação com 1,7% na amostra FANS negativa para NeuN), que têm uma atividade transcricional maior (2.660 genes/núcleo e 6.170 transcritos/núcleo na amostra não classificada pelo FACS) do que a atividade transcricional média de todos os tipos de células não neuronais (1.090 genes/núcleo e 1.785 transcritos/núcleo, Figura 2I).

Juntos, esses resultados representativos mostram que a seleção de núcleos negativos de NeuN usando FANS é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células de baixa abundância do tecido cerebral recém-dissecado e realizar perfis transcriptômicos de núcleos únicos de alta qualidade dessas populações celulares distintas por meio de métodos de snRNA-seq.

Figura 1 Suplementar: Validação da imunocoloração para FANS. A suspensão de núcleos foi incubada (A) sem o anticorpo anti-NeuN-AF 488 como controle negativo ou (B) com o anticorpo e executada através do classificador FACS para validar as condições de imunocoloração. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Análise da expressão gênica e reagrupamento do aglomerado de astrócitos. (A) Gráfico UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) mostrando o agrupamento de 4968 núcleos com base em perfis de expressão genômica ampla da Figura 2F. As chamadas do tipo célula foram feitas com base em marcadores do tipo célula. (B) Aglomerado de astrócitos composto por 2579 núcleos escolhidos de (A) para sub-configuração adicional para investigar potenciais subtipos celulares. Quatro subtipos foram detectados por agrupamento de Seurat (0-3), mostrados por diferentes cores. (C) Níveis de expressão gênica de marcadores celulares específicos nos quatro tipos de células. Todas as parcelas foram obtidas utilizando-se o pacote R de Seurat²⁴. Resumidamente, as contagens de RNA-seq foram normalizadas para cada célula pela expressão total e multiplicadas pelo fator de escala (10.000). Esse resultado foi então transformado em log. Os valores transformados foram dimensionados (variância escalada para um) e centrados (média definida como zero) dentro de cada célula antes da aplicação do UMAP para o cálculo das incorporações, que foram utilizados como valores nos eixos x e y. Os gráficos representam a saída de uma técnica de redução dimensional em um gráfico de dispersão 2D onde cada ponto representa uma célula com as respectivas coordenadas x e y com base nas incorporações de células determinadas pela técnica de redução. Células com assinaturas genéticas semelhantes são posicionadas próximas umas das outras pelas incorporações. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Análise da expressão gênica de NeuN na linhagem neurogênica. (A) Gráfico UMAP mostrando o agrupamento de linhagens neurogênicas a partir de um conjunto de dados publicamente disponível¹⁵. As UMAPs foram geradas como na Figura 2 Suplementar. (B) Níveis de expressão gênica de marcadores celulares específicos em toda a linhagem neurogênica mostrando astrócitos (Aquaporina 4 = Aqp4), NSCs (proteína somente de homeodomínio = Hopx), NeuN/Rbfox3 (NSCs e células progenitoras intermediárias [IPCs]) e células cicladoras (quinase 6 dependente de ciclina = Cdk6). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Composições de meios e tampões utilizados no estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Para executar com sucesso este protocolo, a dissecção do GD é o primeiro passo crítico, que requer alguma prática para mantê-lo intacto e limitar a contaminação dos tecidos circundantes. A partir da experiência, a separação do DG do hipocampo poderia ser adquirida muito rapidamente por um pesquisador qualificado que poderia então trabalhar no refinamento de sua técnica para aumentar a rapidez da dissecção e, portanto, melhorar o frescor do tecido para gerar dados de alta qualidade. Na mesma linha, a preparação e a ressuspensão de núcleos únicos exigem consistência entre as diferentes condições usadas em um único experimento, mas também evitam a pipetagem excessiva que poderia interromper a liberação de RNAs ambientais da membrana nuclear que enviesarão os resultados do sequenciamento. Além das recomendações mencionadas anteriormente para preparar núcleos de alta qualidade, a concentração da suspensão de núcleos únicos também deve ser considerada antes de prosseguir com o sequenciamento. De fato, de acordo com as diretrizes do fabricante, uma preparação com uma concentração superior a 1.200 nuc/μL deve ser diluída, pois esse nível de concentração de núcleos terá maior risco de formar múltiplos que afetam as análises bioinformáticas a jusante. É importante notar que o sequenciamento de amostras com concentrações de núcleos abaixo de 500 nuc/μL pode não valer a pena devido ao custo envolvido. Também é recomendável seguir o conselho de um usuário avançado do FACS para configurar todo o bloqueio e permanecer consistente com as configurações entre amostras e replicações biológicas. Da mesma forma, a preparação de bibliotecas para o sequenciamento de RNA envolve algum treinamento para alcançar resultados de alta qualidade e a maioria dos fornecedores tem um excelente suporte para alcançar isso de forma eficiente. Este método só foi testado com tecido fresco neste estudo; no entanto, o FANS também foi realizado com tecido congelado²⁵. Portanto, é razoável supor que este protocolo poderia ser realizado com tecido congelado, embora com menor otimização.

Este protocolo foi desenvolvido com uma aplicação particular a jusante em mente, que é investigar populações de células que não sejam neurônios dentro do nicho neurogênico do hipocampo. De fato, linhas crescentes de evidências indicam que o comprometimento da AHN no envelhecimento pode ser atribuído às células circundantes dentro do nicho 1,2,3,9. Em particular, astrócitos e oligodendrócitos emergem como reguladores-chave da AHN; no entanto, seu isolamento do GD aliado ao sequenciamento de RNA tem gerado resultados mistos, tornando essa hipótese desafiadora para avaliação com essa técnica ^1,17. Essa abordagem de classificação de núcleos NeuN-negativos para FACS permitiu o isolamento de mais astrócitos e oligodendrócitos em comparação com amostras que não foram classificadas por FACS, o que permite uma melhor análise bioinformática. Este protocolo é aplicável em todas as idades ao longo da vida e os dados representativos apresentados aqui com tecidos de animais idosos fornecem uma prova de conceito de que este método é robusto para investigar o nicho neurogênico hipocampal envelhecido. Para expandir o uso desse método e adaptá-lo para diferentes questões biológicas, é importante considerar que outros antígenos de membrana nuclear neuronal poderiam ser testados juntamente com uma titulação completa dos anticorpos mais bem validados para esses marcadores. Por exemplo, ao estudar o processo de diferenciação neuronal de NSCs no GD, alguns tipos de células, como células tipo 2 ou neuroblastos, começam a expressar NeuN (Figura suplementar 3). Portanto, outro antígeno seria necessário para investigar especificamente esses tipos de células. Por outro lado, alguns neurônios ainda foram identificados neste estudo após a classificação de FACS NeuN-negativo, possivelmente devido à baixa ou nenhuma expressão de NeuN nessas populações (por exemplo, neurônios corticais de Cajal-Retzius¹⁹). Além disso, foi relatado que o NeuN é expresso em subpopulações de oligodendrócitos²⁶, o que poderia dar resultados tendenciosos se essas subpopulações fossem de interesse. Assim, a escolha do antígeno ao iniciar o uso de FANS deve ser cuidadosamente considerada para evitar a inclusão ou exclusão de populações celulares que impeçam uma resposta precisa a uma questão biológica específica. De acordo com isso, recomenda-se também que cada resultado de sequenciamento seja validado por ensaios ortogonais (por exemplo, imuno-histoquímica ou RNA-escopo) antes de validar ou refutar a hipótese testada com este protocolo. Finalmente, a etapa envolvendo FANS poderia ser desenvolvida para incluir mais de um anticorpo com uma estratégia de classificação mais elaborada para excluir e/ou incluir as populações celulares desejadas.

Em última análise, as tecnologias descritas neste protocolo podem ter algumas limitações quando usadas com outras espécies. Por exemplo, o nicho é muito bem definido em roedores com a presença de NSCs proliferativos e quiescentes ou neurônios recém-nascidos restritos dentro de sub-regiões específicas do GD, mas ainda não está claro como o nicho neurogênico do hipocampo deve ser delineado em outras espécies. De fato, as células proliferativas não estão alinhadas dentro de uma zona contínua do GD em primatas não humanos e humanos, mas estão espalhadas ao redor dela e também podem estar presentes na amígdala⁷. Portanto, dissecar e isolar áreas mais amplas do que o GD em outras espécies potencialmente impactaria o uso deste protocolo. Particularmente, as etapas de dissociação e trituração para o preparo do tecido precisarão ser otimizadas ao trabalhar com pedaços maiores de tecido^27,28. Em relação à análise bioinformática, enquanto os roedores endogâmicos alojados têm um genoma muito homogêneo e muito bem anotado, a variabilidade genética do genoma humano combinada com um número insuficiente de marcadores celulares para distinguir claramente diferentes populações celulares (por exemplo, NSCs e astrócitos) requer muita normalização para análise que pode levar a conclusões diferentes quando um pequeno aglomerado de células é identificado^{7, 11}. Em tais situações, o enriquecimento celular ainda pode ser uma opção preferida ou deve ser usado em conjunto com outras estratégias para aumentar o poder analítico.

No entanto, a abordagem atual pode permitir a investigação do papel de populações celulares pouco estudadas, embora potencialmente importantes, na regulação da AHN. Este pode ser particularmente o caso de populações de astrócitos, que desempenham um papel central no aparecimento e progressão de doenças neurodegenerativas^29,30. Este estudo demonstrou que os astrócitos e outras populações celulares raras podem ser identificados e perfilados simplesmente excluindo a grande maioria dos neurônios presentes no GD. Outros estudos utilizando diferentes abordagens não foram capazes de alcançar recuperação semelhante de núcleos da mesma faixa de populações celulares 5,11,17. Além disso, os resultados deste estudo demonstram que é possível utilizar essa abordagem para isolar um cluster NSC sem enriquecimento específico dessa população celular¹⁵.

Em conclusão, seguir e melhorar este método seria um passo em frente para abordar questões pendentes relacionadas com o papel contextual do nicho neurogénico hipocampal para a modulação da AHN. Em particular, poderia trazer novos insights sobre os níveis de expressão gênica em cérebros envelhecidos e doentes em populações celulares associadas à regulação do AHN⁹, apoiar a identificação de uma potencial heterogeneidade dos NSCs¹ ou abordar o papel da vasculatura no AHN. Em última análise, este método poderia ser adaptado para outros nichos de células-tronco adultas com perguntas e problemas semelhantes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5ml microtubo	Eppendorf	30124537
10.00µ m Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	15700-10
15 mL tubos de centrífuga de polipropileno	Corning	430052
2 pares de pinças estéreis Dumont #5 Fine	Science Tools	11252-30
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
4150 TapeStation System	Agilent	N/A
Tubo de ensaio de polipropileno de alta clareza de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão	Falcon	352063
Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com tampa de pressão de filtro de célula	Falcon	352235
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL	Corning	430829
70 µ filtro de células m	Falcon	352350
8 pico SPHERO Rainbow Calibration Particles	BD Biosciences	RCP-30-5A
Accudrop Beads	BD Biosciences	N/A
Allegra X-30R Centrífuga	Beckman Coulter	N/A
Anti-NeuN anticorpo, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugado	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citômetro de Fluxo de Fusão	BD Biosciences	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
Controlador de Cromo	10x Genômica	N/A
Chromium Next GEM Kits de Reagentes de Célula Única 3' v3.1	10x Genômica	PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7.5%	Gibco	15260037
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0861
Conjunto de moedor de tecidos Dounce: almofariz, pilão solto (A) e pilão apertado (B)	KIMBLE	D8938-1SET
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml	Eppendorf	30108116
Halt, 100x Inibidor de protease	ThermoFisher	78429
HiSeq 4000 Sistema de sequenciamento	Illumina	N/A	Configuração de sequenciamento: 28-8-0-91
KCl	Qualquer fornecedor		Feito em laboratório
LUNA-FX7 Contador de células automatizado	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Qualquer fornecedor		Feito em laboratório
N° 10 bisturis descartáveis estéreis guardados	Swann-Morton	6601
Água livre de nuclease	Sigma Aldrich	W4502-1L
Par de tesouras cirúrgicas estéreis para estudantes	Ferramentas de Ciência Fina	91401-12
PBS	Qualquer fornecedor		Inibidor
RNase feito em laboratório 40 U µ l-1	Ambion	AM2684
RNasin 40 U µ l-1	Promega	N211A
placa de Petri estéril	Corning	430167
Sacarose	Sigma Aldrich	59378-500G
Tris tampão, pH 8.0	Qualquer fornecedor		Laboratório feito
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Trypan azul	Invitrogen	T10282