Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Summary

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abstract

Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Introduction

Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas ^1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6.

Protocol

Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação.

NOTA: Um fluxograma das etapas do experimento em sua ordem cronológica é dado na Figura 1.

Results

Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único³⁰ de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está representado na .......

Discussion

Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular ^27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno^32,33,34

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anfotericina B	Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	1397-89-3
Cabeça de microscópico de força atômica (AFM)	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	JPK00518
Cola de amostra biocompatível	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, EUA	14948	Mancha permeável à membrana celular, usada para classificação de disco de cartilagem - imagem de vista superior
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, comprimento nom: 115μ m, largura nom: 40μ m,  geometria: ponta retangular, cilíndrica com um 5μ m raio final
Dispositivo de ctting de cartilagem	Feito por si mesmo	n/a	Dispositivo de corte de plástico contendo inteiros predefinidos de câmera CDD de 4 mm x 1 mm
integrada no AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Alemanha	DFK 31BF03
integrada no microscópio de fluorescência	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha	CM3050S
software de processamento de dados para a AFM	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	n/a	Versão 5.0.86,  pode ser baixado gratuitamente do seguinte site https://customers.jpk.com
meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemanha	41966052
Microscópio de fluorescência (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha	11889113
Suporte de cantiliver de bloco de vidro	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	SP-90-05	Bloco de vidro extra longo com faces angulares, projetado especialmente para uso com o JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscópio de contraste de fase invertida (integrado no AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemanha	L201306_03
Meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina	Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	F1315
Lâminas de vidro para microscópio	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA	CLS294775X50
Meio de montagem Com DAPI	ibidi GmbH, Grä felfing, Alemanha	50011	Mídia de montagem com contracoloração nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) usada para discos de cartilagem  imagem de vista lateral
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA Aquecedor de	P4333
associado ao AFM (Aquecedor de Placa de Petri)	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	T-05-0117
Bisturi	Feather Medical Products, Osaka, Japão	2023-01
Saia de Silicone	Bruker Nano GmbH, Berlim, Alemanha	n/a	Membrana protetora de silicone (D55x0.25) que é colocada na base do bloco de vidro para prevenir a condensação média na cabeça do AFM.
Programa estatístico - SPSS	IBM, Armonk, Nova York, EUA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Placas de cultura de tecidos	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suíça	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holanda	SA6255012	Meio de incorporação solúvel em água