Artigo de método

Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

DOI:

10.3791/64371

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28 de outubro de 2022

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1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Resumo

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Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Introdução

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Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas 1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6.

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Protocolo

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Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação.

NOTA: Um fluxograma das etapas do experimento em sua ordem cronológica é dado na Figura 1.

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Resultados

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Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único30 de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está representado na .......

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Discussão

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Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular 27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno32,33,34

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos aos cirurgiões ortopédicos do Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen pelo fornecimento das amostras de tecido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anfotericina BMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1397-89-3
Cabeça de microscópico de força atômica (AFM)CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlim, AlemanhaJPK00518
Cola de amostra biocompatível Bruker Nano GmbH, Berlim, AlemanhaH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, EUA14948Mancha permeável à membrana celular, usada para classificação de disco de cartilagem - imagem de vista superior
CantileverBruker Nano GmbH, Berlim, AlemanhaSAA-SPH-5UMFrequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, comprimento nom: 115μ m, largura nom: 40μ m,  geometria: ponta retangular, cilíndrica com um 5μ m raio final
Dispositivo de ctting de cartilagem Feito por si mesmo n/aDispositivo de corte de plástico contendo inteiros predefinidos de câmera CDD de 4 mm x 1 mm
integrada no AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, AlemanhaDFK 31BF03
integrada no microscópio de fluorescênciaLeica Biosystems, Wetzlar, AlemanhaDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, AlemanhaCM3050S 
software de processamento de dados para a AFMBruker Nano GmbH, Berlim, Alemanhan/aVersão 5.0.86,  pode ser baixado gratuitamente do seguinte site https://customers.jpk.com
meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemanha41966052
Microscópio de fluorescência (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha11889113
Suporte de cantiliver de bloco de vidroBruker Nano GmbH, Berlim, AlemanhaSP-90-05Bloco de vidro extra longo com faces angulares, projetado especialmente para uso com o JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscópio de contraste de fase invertida (integrado no AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, AlemanhaL201306_03
Meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaF1315
Lâminas de vidro para microscópioSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUACLS294775X50
Meio de montagem Com DAPIibidi GmbH, Grä felfing, Alemanha50011Mídia de montagem com contracoloração nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) usada para discos de cartilagem  imagem de vista lateral
Penicilina-EstreptomicinaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA Aquecedor deP4333
associado ao AFM (Aquecedor de Placa de Petri)Bruker Nano GmbH, Berlim, AlemanhaT-05-0117
BisturiFeather Medical Products, Osaka, Japão2023-01
Saia de SiliconeBruker Nano GmbH, Berlim, Alemanhan/aMembrana protetora de silicone (D55x0.25) que é colocada na base do bloco de vidro para prevenir a condensação média na cabeça do AFM.
Programa estatístico - SPSSIBM, Armonk, Nova York, EUASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Placas de cultura de tecidos TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SuíçaTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, HolandaSA6255012Meio de incorporação solúvel em água 
Câmera CDD O placa de Petri

Referências

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  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application o....

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