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Research Article
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Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.
As células podem mudar ativamente suas formas e se tornar móveis, uma propriedade que depende de sua capacidade de reorganizar ativamente sua estrutura interna. Essa característica é atribuída às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, notadamente o citoesqueleto da actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores de miosina e proteínas acessórias que exibem propriedades de contração intrínsecas. A visão usualmente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico. No entanto, esse modelo nem sempre pode explicar os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto como um material ativo poroelástico - uma rede elástica embebida com citosol. Gradientes de contratilidade gerados pelos motores da miosina conduzem o fluxo do citosol através dos poros do gel, o que infere que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados. Uma das principais características da poroelasticidade é a relaxação difusiva das tensões na rede, caracterizada por uma constante de difusão efetiva que depende do módulo elástico do gel, porosidade e viscosidade do citosol (solvente). Como as células têm muitas maneiras de regular sua estrutura e propriedades materiais, nossa compreensão atual de como a mecânica do citoesqueleto e a dinâmica do fluxo citosol são acopladas permanece pouco compreendida. Aqui, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para caracterizar as propriedades materiais de géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo para o citoesqueleto celular. A contração do gel é impulsionada pela contratilidade motora da miosina, que leva ao surgimento de um fluxo do solvente penetrante. O artigo descreve como preparar esses géis e executar experimentos. Também discutimos como medir e analisar o fluxo de solvente e a contração do gel em escala local e global. As várias relações de escala usadas para quantificação de dados são dadas. Finalmente, os desafios experimentais e as armadilhas comuns são discutidos, incluindo sua relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.
As células vivas têm propriedades mecânicas únicas. Além da capacidade de reagir passivamente às forças aplicadas, elas também são capazes de gerar ativamente forças em resposta a estímulos externos1. Essas características, essenciais para uma variedade de processos celulares, notadamente durante a motilidade celular, são primariamente atribuídas às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, especialmente do citoesqueleto de actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina e proteínas acessórias. Essas redes de actomiosinas exibem propriedades intrínsecas de auto-organização e contração impulsionadas pelas proteínas motoras da miosina, que reticulam os filamentos de actina e geram ativamente tensões mecânicas na rede alimentada pela hidrólise de ATP2.
Inúmeros estudos experimentais e teóricos têm sido realizados para estudar as propriedades materiais do citoesqueleto3. A visão comumente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico4. Isso significa que, em escalas de tempo curtas, o citoesqueleto se comporta como um material elástico e, em longas escalas de tempo, comporta-se como um fluido viscoso devido às proteínas de reticulação e ao descolamento motor (e religação) da miosina, o que permite que a rede se transforme dinamicamente. Em muitas situações, entretanto, o modelo viscoelástico não consegue descrever os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto e, de modo mais geral, o citoplasma da célula sendo descrito como um material ativo poroelástico 5,6. Duas características principais caracterizam esses tipos de materiais. (i) A primeira característica principal é a geração de um fluxo do citosol penetrante (o "solvente") através dos poros do gel por gradientes de contratilidade impulsionados pelos motores da miosina, que está subjacente a processos como o blebbing celular7, a motilidade8 e as oscilações da forma celular9. O surgimento desses fluxos citosólicos pode ser local, por blebbing, ou global, como na motilidade celular. Neste último caso, as tensões contráteis aplicadas na parte traseira da célula direcionam o fluxo do fluido citosólico em direção à frente celular, o que repõe o pool proteico necessário para a montagem dos lamelípodes8. (ii) A segunda característica principal é que a relaxação das tensões é difusiva e é caracterizada por uma constante de difusão efetiva, que depende do módulo elástico do gel, da porosidade do gel e da viscosidade do solvente5. A constante de difusão poroelástica determina a rapidez com que o sistema responde a uma tensão aplicada. Constantes de maior difusão correspondem a uma redistribuição mais rápida das tensões. Isso, por sua vez, determina quanto tempo leva para que o líquido citosólico intracelular seja redistribuído dentro da célula após o estresse mecânico aplicado, seja ele externo ou interno, como os estresses contráteis ativos gerados pelos motores da miosina. Esses exemplos, portanto, demonstram que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados e não podem ser tratados separadamente3.
Como as células podem regular suas propriedades mecânicas de várias maneiras, a interação entre a mecânica da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos permanece pouco compreendida. Uma abordagem alternativa poderosa é a utilização de sistemas reconstituídos in vitro que permitam o controle total dos vários constituintes microscópicos e dos parâmetros do sistema, o que torna esses sistemas-modelo ótimos para análises físicas10,11. Esta abordagem tem sido empregada com sucesso para estudar o impacto da composição proteica e da geometria do sistema na motilidade baseada em actina 12,13,14,15,16,17,18, na padronização 2D de redes de actomiosinas 19,20,21,22, e a interação entre a contratilidade da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos de géis de actomiosina poroelásticos, que é o foco deste artigo23.
Neste manuscrito, a preparação de redes de actomiosina elástica contrátil de dimensões controláveis e propriedades do material é discutida com base no trabalho de Ideses et al.23. A dinâmica do gel de contração e do solvente drenado é analisada e quantificada, através da qual é demonstrado que estes géis de actomiosina podem ser descritos como um material ativo poroelástico. O estudo do efeito da viscosidade do solvente na difusividade de tensões confirma ainda mais a natureza poroelástica dessas redes. As várias relações de dimensionamento usadas para quantificação de dados são fornecidas. Finalmente, os desafios experimentais, as armadilhas comuns e a relevância dos resultados experimentais para o citoesqueleto celular também são discutidos.
1. Tratamento da superfície do vidro e passivação:
NOTA: Esta seção inclui três etapas principais (consulte a Figura 1): (i) limpeza e hidrofilização, (ii) silanização e (iii) passivação superficial.
2. Purificação de proteínas
3. Preparo da amostra
OBS: Polimerizar os monômeros de actina na presença de grandes agregados de motores de miosina II e a forte fascina passiva reticulante para produzir macroscopicamente redes de actomiosina elásticacontráteis 19,23. A adição de esferas fluorescentes à solução permite rastrear o fluxo de solvente durante a contração do gel.
4. Executando um experimento
5. Técnicas de microscopia
Duas lamínulas de vidro são usadas por experimento. As lamínulas de vidro são limpas e passivadas com polímeros PEG. A passivação é essencial para impedir que as proteínas solubilizadas aderam às superfícies de vidro nos estágios experimentais iniciais e para minimizar a interação da rede de contração com as paredes de vidro. A falha em alcançar uma boa passivação pode levar a uma contração ineficiente e, em casos extremos, pode até inibir a formação da rede de actina.
A Figura 1 descreve as três principais etapas do procedimento de tratamento de superfície. Essas etapas incluem: (i) limpeza e hidrofilização da superfície com solução de Piranha, que remove a contaminação orgânica das superfícies de deslizamento e expõe os grupos OH na superfície do vidro; (ii) silanização superficial com (3-Mercaptopropil)trimetoxissilano, que visa ligar covalentemente o silano à superfície de vidro, onde cada molécula de silano termina com um grupo SH; (iii) passivação com polímeros de PEG (mPEG-mal, 5 kDa) - nesta etapa, o grupo maleimida do polímero de PEG interage covalentemente com o grupo SH sobre o (3-Mercaptopropil)trimetoxissilano, resultando na formação de uma monocamada de PEG na superfície do vidro.
Para o tratamento e silanização da piranha, 10-12 lamínulas de vidro #1,5 (22 mm x 22 mm) são colocadas em um suporte de politetrafluoretileno (Figura 2A), e esse suporte é transferido para um copo de 400 mL. Para a etapa de passivação, duas lamínulas de vidro são transferidas para uma placa de Petri revestida com parafilme (Figura 2B). A colocação das lamínulas em uma camada de parafilme hidrofóbico garante que a solução de polímero de PEG hidrofílico permaneça confinada à superfície de vidro durante todo o tempo de incubação. Cada lamínula é incubada com 1 mL de 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal em 1x PBS por 1 h a 22 °C (Figura 2B). Para esse polímero de PEG a massa molecular e concentração, a passivação vítrea leva à formação de uma monocamada de PEG, onde cada polímero PEG está em uma conformação semelhante a um cogumelo29. Ao final do processo de incubação, cada lamínula é lavada com 5 mL de DDW e seca com fluxo de N2 (gás). Se as lamínulas não forem usadas imediatamente, 1 mL de Tris 10 mM deve ser colocado nas superfícies peguiladas para manter as superfícies de deslizamento molhadas. As lamínulas são secas com um fluxo de N2 (gás) pouco antes de iniciar um experimento. É melhor usar as tampas dentro de 2 h.
Macroscopicamente, as redes elásticas contráteis de actomiosina são formadas pela mistura de 5 μM de G-actina com 16,7 nM de miosina, que é adicionada na forma de grandes agregados (~150 dímeros/agregados de miosina) e 280 nM da forte faccina reticulante. A solução inclui 1 mM ATP, que é mantido constante usando um sistema regenerador de ATP e uma solução anti-branqueamento (veja detalhes na seção de protocolo). Para analisar o fluxo do solvente penetrante, esferas fluorescentes são adicionadas à solução de actomiosina.
Os experimentos são realizados em um porta-amostras caseiro, que se ajusta às dimensões de um estágio padrão do microscópio (Figura 3). Um espaçador de parafilme untado de espessura h (~150 μm) é colocado em uma das duas lamínulas passivadas por PEG, e essa lamínula é colocada no porta-amostras (Figura 3A). Em seguida, a solução de actomiosina é preparada sobre gelo em um tubo de microcentrífuga, incorporando os vários constituintes microscópicos, adicionando por último a G-actina, agregados de miosina e, em seguida, EGTA, que desencadeia a polimerização da actina. A solução deve ser bem misturada - isso define o tempo de início dos experimentos (t = 0). Imediatamente, 1,1 μL dessa solução é colocado sobre a lamínula (Figura 3B), a segunda lamínula passivada por PEG é colocada sobre ela (Figura 3C) e o suporte é parafusado para confinar a gota entre elas (Figura 3D). Para esse volume de gota e tipo de espaçador, o diâmetro da gota é de cerca de 3.000 μm, mas os pesquisadores não devem se basear nesses valores estimados. A espessura e o diâmetro reais da gota devem sempre ser medidos diretamente das imagens de microscopia. Para a espessura, um microscópio confocal deve ser usado.
O porta-amostras é colocado no microscópio e a aquisição é iniciada. O microscópio deve ser preparado com antecedência para reduzir ao mínimo o tempo de início da aquisição. Normalmente, leva de 1 a 2 minutos para iniciar a imagem da amostra. As amostras são excitadas a 488 nm e/ou 561 nm e fotografadas usando um microscópio fluorescente invertido controlado por um software dedicado. As imagens devem ser adquiridas a uma taxa de 100 ms por quadro (ou menos) no modo de streaming com uma câmera EMCCD. Para obter imagens simultâneas da rede de actina e dos agregados motores de miosina, ou das esferas fluorescentes na solução, um sistema de dupla emissão deve ser usado. A intensidade da lâmpada fluorescente deve ser mantida o mais baixa possível para evitar a saturação do sinal nos estágios avançados de contração da rede.
Uma objetiva Plan-NEOFLUAR de 2,5x/0,075 é usada para caracterizar a dinâmica de contração lateral do gel e a direcionalidade e velocidade do fluxo de fluido na escala de comprimento do gel. Estas são imagens de baixa resolução que são úteis para acompanhar as mudanças no raio do gel com o tempo, a partir do qual a velocidade de contração radial (lateral) do gel pode ser deduzida. Para resolver a estrutura e porosidade da rede, a localização dos agregados motores de miosina dentro da rede e o movimento de esferas fluorescentes individuais através dos poros do gel, objetivos de ampliação mais altos devem ser usados (por exemplo, uma objetiva UPlanFL de 10x/0,3 Ph1). Ampliações mais altas também podem ser usadas, mas às custas de um campo de visão reduzido, o que é mais significativo se o modo de imagem de duas cores for empregado. Os dados da microscopia de fluorescência (2D) devem ser complementados com imagens confocais do gel em contração em 3D para caracterizar a dinâmica da contração nas direções lateral e vertical. A microscopia confocal é usada para medir o espaçamento entre as duas lamínulas - essa distância define a espessura inicial do gel. Além disso, a espessura do gel deve ser medida no final do experimento, quando um estado mecanicamente estável é alcançado.
Vários critérios precisam ser preenchidos para mostrar que as redes de actomiosina se comportam como um material poroelástico: (i) a rede não se remodela, o que infere que ela se comporta como um material elástico (Figura 4), (ii) o fluxo de água (solvente) através dos poros do gel é impulsionado pela contratilidade da miosina (Figura 5), e (iii) o relaxamento do estresse elástico é caracterizado por uma constante de difusão efetiva, D ~ κ/γ, que depende do módulo elástico efetivo do gel, κ, e da constante de atrito efetiva, γ, que responde pelo atrito entre o solvente em movimento e os poros do gel (Figura 6). A seguir, discutimos cada critério separadamente e demonstramos como eles são cumpridos no sistema atual.
Objectivo (i)
Primeiramente, a estrutura e a porosidade do gel devem ser analisadas, e deve-se determinar se a rede está se remodelando dinamicamente. Uma representação esquemática da rede de actomiosinas é mostrada na Figura 4A. A formação da rede inicia-se com a nucleação espontânea e polimerização dos filamentos de actina, que posteriormente se agrupam (Figura 4B). A rede então se auto-organiza ativamente em uma rede macroscopicamente isotrópica interconectada de feixes de actina, que dinamicamente se engrossa com o tempo e, eventualmente, se contrai. A auto-organização e contração da rede são conduzidas pelos agregados de miosina, que se localizam predominantemente nos pontos de intersecção dos feixes filamentares (Figura 4C). Os agregados de miosina permanecem aderidos à rede através da contração do gel, podendo-se concluir que esses géis de actomiosina comportam-se como materiais elásticos ativos (Figura 4C). Além disso, nesses géis de actomiosina, a contração é governada pelo deslizamento dos filamentos, como deduzido comparando-se as distâncias término-a-ponta dos feixes filamentares, l término-a-extremo e comprimentos de contorno, lcont(Figura 4D,E). Isso contrasta com a contração dos feixes soltos de actina reticulados pela α-actinina, que são dominados pela flambagem do filamento de actina29.
A porosidade do gel é caracterizada pelo tamanho dos poros do gel através dos quais o fluxo de solvente se move. Para redes de actina purificadas, o tamanho da malha, que define a distância entre as ligações cruzadas no gel (aqui, os agregados de miosina), fornece uma boa estimativa também do tamanho dos poros do gel. A malha pode ser extraída diretamente das imagens de fluorescência (2D) e é avaliada a partir da média geométrica das distâncias entre pares de feixes de actina opostos em um poro de gel (Figura 4B). Como a rede é isotrópica até o início da contração, os tamanhos médios das malhas nas direções vertical (isto é, ao longo da espessura) e lateral (ao longo do raio) são os mesmos, ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 (= 67 μm). Como os feixes de actina permanecem retos durante a contração, os tamanhos da malha e dos poros diminuem proporcionalmente às mudanças na espessura e diâmetro do gel. Para o sistema experimental atual, a contração no plano (radial) inicia-se após a contração vertical praticamente terminar (não mostrada), de modo que a contração radial prossegue a uma espessura de gel constante menor do que a espessura inicial por um fator de ~0,3. Consequentemente, enquanto o tamanho da malha dentro do plano de contração, ξ ll (t) = r(t)/R, diminui durante a contração radial, onde r(t) é o raio do gel no tempo t, o tamanho médio da malha no sentido perpendicular é constante, ξ = 20μm23. Esses valores das malhas/poros são utilizados para avaliar o módulo elástico do gel, κ e o coeficiente de atrito, γ, conforme detalhado a seguir (Objetivo [iii], Figura 6).
Objectivo (ii)
Esse objetivo envolve demonstrar que um fluxo de solvente para fora é gerado pela contratilidade da miosina. Para rastrear o fluxo de solvente, esferas fluorescentes são adicionadas à solução de actomiosina. As contas são passivadas para reduzir a interação entre as esferas em movimento e a rede de actomiosina. No geral, 1 μL de contas (Tabela de Materiais) é incubado com 5 μm de G-actina por 20 min à temperatura ambiente, e o excesso de G-actina é removido por centrifugação (Tabela de Materiais, consulte a seção de protocolo para detalhes). Esta etapa é repetida com 10 mg·mL-1 de BSA (Tabela de Materiais). As esferas são adicionadas à solução proteica em uma diluição final de 1:10.000 v/v. Uma vez que o objetivo é permitir que as contas se movam livremente através do poro do gel, é importante adaptar os diâmetros das contas ao tamanho do poro do gel, de modo que sua proporção de tamanho seja sempre <<1. Assim, esferas de 2.300 nm de diâmetro são usadas para analisar os estágios inicial e intermediário de contração (Figura 5A,B) quando o tamanho médio dos poros é maior que 15 μm, e esferas de 200 nm de diâmetro são usadas quando o tamanho dos poros é menor (Figura 5D-G). A posição do centro de massa das esferas é extraída para cada vez, t, (x(t),y(t))), usando um algoritmo padrão de rastreamento de partículas (Tabela de Materiais), do qual a trajetória (Figura 5B) e a velocidade local do talão, ,
podem ser deduzidas. As esferas e, portanto, o solvente penetrante, movem-se, em média, na direção radial para fora (Figura 5A,B), enquanto o gel se contrai para dentro, como mostrado pela análise de velocimetria por imagem de partículas (PIV) (veja as setas verdes na Figura 6A). Este movimento radial pode ser mais elaborado extraindo-se a velocidade radial das esferas locais, νr, que é avaliada projetando-se a velocidade do cordão local na direção radial definida pelo vetor unitário, , conectando o centro do gel (x 0, 
y0) e a posição do centro de massa do talão no tempo t: 
em que 
Os dados mostram que, à medida que as esferas se movem para fora do centro do gel, suas velocidades inicialmente aumentam e, em seguida, diminuem à medida que se aproximam do limite do gel (Figura 5C). Notadamente, a velocidade do cordão pode ser 20 vezes maior que a velocidade de contração radial do gel (curva azul na Figura 5C). Os círculos preenchidos marcam o momento em que as contas saem do gel. As contas continuam a se mover depois de sair do limite de gel por algum tempo. Esse movimento não pode resultar de efeitos inerciais, uma vez que o número de Reynold é <10-4. A velocidade do cordão radial diminui com o tempo concomitante à diminuição da contração do gel; Notavelmente, quando a velocidade de contração radial do gel diminuiu significativamente, a velocidade das contas flutua significativamente.
Para testar se essas flutuações resultam da estrutura porosa da actomiosina, a rede rastreia o movimento das esferas em uma resolução espacial mais alta, o que é possível quando a contração do gel diminuiu significativamente (Figura 5D-F). A trajetória das contas é de fato tortuosa (Figura 5D,E), com flutuações significativas na velocidade local das contas, o que reflete a estrutura porosa do gel, ou seja, a velocidade local é mais rápida próxima ao centro dos poros e mais lenta nas proximidades de um feixe de actina (Figura 5F).
Finalmente, o cálculo da função de correlação velocidade do gel e velocidade do solvente demonstra que localmente o fluxo do fluido é direcionado para o oposto ao gel em contração. Usando pontos brilhantes locais no gel como marcadores fiduciais, sua posição de centro de massa para cada ponto de tempo, t, (x(t),y(t))gel, pode ser calculada, e a velocidade local do gel pode ser derivada: 
. Em seguida, para cada talão e um ponto próximo no gel, a correlação do par velocidade do cordão local e velocidade do gel é calculada para extrair o ângulo, θ, entre os dois vetores: 
, onde 
e são as velocidades locais (magnitude) do talão e 
do gel, respectivamente. Os dados mostram que, independentemente da posição do talão dentro do poro do gel, localmente, o fluxo de fluido é direcionado na direção oposta em relação ao gel (Figura 5G). De modo geral, os resultados mostram que um fluxo de líquido externo é gerado pela contratilidade da miosina, como esperado para um material ativo poroelástico 3,7,23,30.
Objectivo (iii)
Este objetivo envolve demonstrar que a relaxação de tensões é caracterizada por uma constante de difusão poroelástica efetiva, D, que depende do módulo elástico da rede, porosidade e viscosidade do solvente. Primeiro, quantifica-se a velocidade lateral (no plano) do gel de contração (Figura 6A). Primeiramente, as imagens de fluorescência são binarizadas, e a área projetada em gel em cada ponto de tempo t, A(t), é extraída. Em seguida, calcula-se o raio do 
gel (Figura 6B). A partir disso, deriva-se a velocidade de contração radial no ponto de tempo t,
que descreve a velocidade da borda do gel (Figura 6C). A velocidade de borda mostra um perfil típico de evolução temporal caracterizado por uma fase linear inicial, na qual a velocidade da borda aumenta a uma taxa constante, até que uma velocidade máxima, ν max, 
é atingida no tempo tmax. A velocidade então decai exponencialmente com um tempo de relaxamento característico, τ, até que um estado mecanicamente estável seja atingido (Figura 6C). O rmaxé o raio de gel no início dessa fase de relaxamento.
Para um material poroelástico, o tempo 
de relaxamento , onde 
é uma constante de difusão poroelástica efetiva, κ é um módulo de gel elástico efetivo, e γ é uma constante de atrito efetiva que responde pelo movimento da solução aquosa através dos poros do gel de actina. O módulo de elasticidade tem unidades de energia por unidade de volume e é inversamente proporcional ao volume de uma célula unitária no gel, determinado pela distância entre ligações cruzadas ou o tamanho da malha, tal que 
. O coeficiente de atrito, γ, depende da faceta dos poros perpendicular ao fluxo do solvente. Para a contração do gel no plano, a faceta de poros relevante é , e, consequentemente, o coeficiente 
de atrito, onde η é 
a viscosidade do solvente31,32. De modo geral, obtemos a seguinte relação: 
, onde o tamanho 
relevante dos poros no plano é avaliado em tmax. Em conjunto, obtém-se 
, o que infere que o tempo de relaxação deve escalar linearmente com a viscosidade do solvente23.
Para testar se essa relação é obedecida, os experimentos são repetidos com diferentes quantidades de glicerol. O uso do glicerol é vantajoso, pois não se espera que afete a atividade das proteínas, particularmente os motores da miosina. Além disso, correlações entre a viscosidade das soluções de água-glicerol e a quantidade de glicerol adicionado estão disponíveis na literatura28. Essas correlações mostram que um aumento na porcentagem de peso do glicerol de 0% para 34% leva a um aumento proporcional na viscosidade da solução de água-glicerol de η ω para 2,76 η ω, onde η ωé a viscosidade da água a 20 °C. Nessa faixa de glicerol e para o mesmo diâmetro inicial da gota, 2R = 2.800 μm, um aumento na viscosidade aumenta a duração das fases de polimerização e auto-organização da rede, embora a aceleração linear e a velocidade máxima de contração radial (νmax) sejam grosseiramente inalteradas. Essas evidências sugerem que tanto a reorganização da rede (porosidade) quanto a atividade da miosina não são afetadas pela viscosidade da solução23, e o efeito da viscosidade do solvente deve ser refletido essencialmente no tempo necessário para que as tensões elásticas relaxem. De fato, o tempo de relaxação mostra uma dependência linear da viscosidade da solução (Figura 6D), o que infere que a relação de escalonamento derivada acima é obedecida, confirmando ainda mais a natureza poroelástica do sistema.
Figura 1: Descrição esquemática das três principais etapas do procedimento de tratamento de superfície de cobertura de vidro. (i) Limpeza da superfície do vidro (tratamento da piranha) e hidrofilização, (ii) silanização da superfície e (iii) passivação com mPEG-mal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Passivação do deslizamento da tampa de vidro. (A) A limpeza e silanização da piranha são realizadas em copo de 400 mL, utilizando-se um suporte caseiro de politetrafluoretileno composto por 12 ranhuras lineares. (B) A passivação superficial é realizada em uma placa de Petri revestida com parafilme. Cada lamínula é incubada com 1 mL de 5 kDa mPEG-mal a 4mg·mL−1 em 1x PBS (Tabela de Materiais) por 1 h a 22 °C. A camada de parafilme hidrofóbico garante que a solução polimérica de PEG hidrofílica permaneça confinada à superfície do vidro durante todo o tempo de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Executando um experimento - o porta-amostras caseiro. Os experimentos são executados em um porta-amostras caseiro que se ajusta às dimensões de um estágio de microscópio padrão. (A) Um espaçador de parafilme untado de espessura h (~150 μm) é colocado em uma lamínula passivada por PEG, e essa lamínula é colocada no suporte da amostra. (B) A solução de actomiosina é preparada sobre gelo em um tubo Eppendorf, e 1,1 μL dessa solução é colocado na lamínula; em seguida, (C) uma segunda lamínula passivada por PEG é colocada sobre ela, e (D) o suporte da amostra é parafusado para confinar a gota, que adota uma forma semelhante a um disco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Objetivo da poroelasticidade (i). A rede de actomiosina comporta-se como um material elástico. (A) Representação esquemática de uma rede de actomiosinas. (B) Formação da rede de actomiosinas. Imagens de microscopia de fluorescência demonstram que os filamentos de actina se nucleam espontaneamente e polimerizam em uma rede isotrópica interconectada que se enrola com o tempo e eventualmente se contrai macroscopicamente. A porosidade da rede é caracterizada pelo tamanho da malha da rede, ξ (seta dupla). (C-E) A contração da rede de actomiosina é impulsionada pelo deslizamento do feixe filamentar de actina. (C) A contração da rede inicia-se na periferia do gel ("P") e propaga-se para dentro do volume do gel. As setas brancas mostram a direção da contração. O centro do gel é marcado com um "C". As imagens fluorescentes mostram que os agregados motores de miosina (561 nm, pontos vermelhos) estão embutidos na rede de actina (488 nm, verde) e permanecem ligados a ela durante toda a contração da rede. (D) Os feixes filamentares de actina permanecem retos durante a contração da rede. A razão entre o comprimento do contorno, l cont, e a distância término-a-extremo, l extremo-fim, em função do tempo. (E) Distribuição da razão entre o comprimento do contorno e a distância término-a-ponta em t = 316 s (vermelho sólido) e t = 327 s (listrado, cinza). Inset: comprimento do contorno (azul) e distância término-a-fim (branco) de um feixe típico. Condições: (B,C,E[inset]): As imagens são adquiridas em microscópio fluorescente invertido com câmera EMCCD e objetiva aérea UPlanFL 10x/0,3 Ph1 em modo regular (B) e em modo dual imaging após sobreposição de imagem (C,E[inset]). As barras de escala são (B,C) 100 μm e (E[inset]) 50 μm. Esse valor foi reproduzido com permissão de Ideses et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Objetivo da poroelasticidade (ii). Um fluxo de solvente para fora é gerado pela contratilidade motora da miosina. (A) Imagem do gel em baixa magnificação em estágios intermediários de contração: imagem simultânea de fluorescência de uma rede de actina em contração (488 nm, esquerda) e esferas fluorescentes de 2.300 nm adicionadas à solução (561 nm, direita) em função do tempo. Os círculos marcam as posições de quatro contas. As setas marcam a direção global do movimento do talão. (B) São descritas as trajetórias de nove contas selecionadas. As setas marcam a direção radial global do movimento das contas. A cruz circundada denota o centro do gel (x0,y0) (C) Velocidade do cordão radial local νr (círculos abertos) e velocidade da borda do gel (radial) (pontos azuis) versus o tempo. Os círculos preenchidos indicam o tempo em que uma determinada conta sai do limite do gel. (D-F) Resolvendo a porosidade da rede e o movimento do solvente através dos poros do gel em estágios avançados de contração. (D) Imagens de epifluorescência do gel contratante e esferas fluorescentes de 200 nm de diâmetro adicionadas à solução. Tanto a actina quanto as contas são excitadas a 488 nm. Os círculos vermelhos seguem a posição de uma conta com o tempo. A linha cinza indica o limite do gel. (E) Trajetória do talão mostrado em (D). No campo mostrado, o gel contrai-se, em média, em direção ao fundo. As coordenadas são medidas em relação à origem da câmera. (F) A velocidade local do cordão reflete a estrutura porosa do gel. Parte superior: velocidade do talão local (círculos abertos), velocidade do gel local (círculos cinzentos) e velocidade da borda do gel (círculos azuis) em relação ao tempo. Parte inferior: os instantâneos mostram a posição do talão para os tempos selecionados. O talão é marcado por um círculo vermelho. A linha tracejada marca a hora em que o talão sai do gel. (G) Distribuição dos ângulos entre as velocidades do gel local e do cordão local. Condições: As imagens são adquiridas em microscópio fluorescente invertido com câmera EMCCD e (A) objetiva Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 e (D,F) UPlanFL 10x/0,3 Ph1. As barras de escala são (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) e 50 μm. Esse valor foi reproduzido com permissão de Ideses et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Objetivo da poroelasticidade (iii). O relaxamento sob tensão é caracterizado por uma constante de difusão poroelástica efetiva. (A) Imagens de fluorescência de visualização superior de um gel de actomiosina em contração em baixa ampliação desde o tempo de mistura até o estado estacionário. O campo de velocidade (setas verdes) é extraído da análise do PIV. As imagens são adquiridas em microscópio fluorescente invertido com câmera EMCCD e objetiva Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075. O comprimento de onda de excitação é de 488 nm (actina). A barra de escala é de 500 μm. (B) Raio de gel e (C) velocidade de contração radial, (ou seja, a velocidade da borda do gel versus o tempo). A denota a aceleração, 
Vmax denota a velocidade máxima e τ é um tempo de relaxamento característico. (D) As redes de actomiosina comportam-se como material ativo poroelástico. 
e viscosidade do solvente, η, versus percentual em peso do glicerol (% em peso). As quantidades são normalizadas para seus valores a 0% em peso de glicerol. O raio inicial do gel é R = 1.400 μm. As barras de erro são os desvios-padrão dos valores experimentais. Esse valor foi reproduzido com permissão de Ideses et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os autores não têm nada a revelar.
Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.
Gostaríamos de agradecer a Dina Aranovich pela purificação e rotulagem das proteínas. G.L. é grato ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Espaço de Israel pela Bolsa de Doutorado Jabotinsky. A.B.G. agradece à Israel Science Foundation (processo 2101/20) e ao Ministério da Ciência e Tecnologia - Estado de Israel (grant 3-17491) pelo apoio financeiro.
| (3-Mercaptopropil)trimetoxissilano | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Armazenado sob atmosfera de argônio a 4 &graus; C |
| Ácido acético | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluído com DMSO, armazenado sob atmosfera de argônio a -20 ° C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluído com DMSO, armazenado sob atmosfera de argônio a -20 ° C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Armazenado em 4 ° C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | O frasco de estoque é mantido em atmosfera seca (gel de sílica) a -20 &graus; C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Mantido em milliQ-água após o tratamento com Piranha e usado dentro de 3 semanas |
| Creatina quinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Preparado fresco em tampão glicina, mantido no gelo e usado dentro de 3 dias. O frasco de estoque é mantido em atmosfera seca (gel de sílica) a 4 & C |
| Fosfato de creatina | Produtos para ciências da vida da Roche | 10621714001 | Quando dissolvido deve ser mantido a -20 & C e usado dentro de 3 meses. A garrafa de estoque é mantida sob atmosfera de argônio e armazenada a 4 graus; C |
| DTT | Produtos para ciências da vida da Roche | 10708984001 | Quando dissolvido deve ser mantido a -20 > C e usado dentro de 3 meses |
| Sistema de Imagem Simultânea de Visualização Dupla | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Câmera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Câmera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Lâmpada de Fluorescência | Rapp Fluoresbrite Optoeletrônica | ||
| YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm de diâmetro |
| Glicose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | Quando dissolvido deve ser mantido a -20 ° C e usado dentro de 3 meses. |
| Glicose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Mantido em -20 ° C e usado dentro de 3 meses. O pó de estoque é mantido sob atmosfera de argônio e mantido a -20 ° C |
| Glicerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Armazenado em 4 ° C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscópio | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Dividido em pequenos lotes em peso. Armazenado sob atmosfera de argônio a -20 &graus; C |
| Microesferas vermelhas do Nilo | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm de diâmetro |
| Objetiva (10x) | Leica Alemanha | HC PL AP0 | UPlanFL Abertura numérica = 0.3 |
| Objetiva (2.5x) | Leica Alemanha | 506304 | Plan-NEOFLUAR Abertura numérica = 0.075 |
| Forno | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Driver do obturador | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Gel de sílica | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Reagentes de ácido sulfúrico | Carlo Erba | 410301 | |
| DV2 Sistema de Imagem Simultânea de Canal Duplo | Photometrics | ||
| Espectrofotômetro UV-VIS | TRIS MP Biomedicals 819620 | Pharmacia Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E Gilson FD10001 1– | |||
| 10 uL | |||
| MATLAB R2017b | MathWorks | Quantificação de dados | |
| Metamorfose | Software | de controle do sistema de imagem óptica; quantificação de dados (análise de rastreamento de partículas, tamanho da malha da rede) |
