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Artigo de método

Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

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DOI:

10.3791/64378

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16 de setembro de 2022

 ,  , 
1SaBio. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos IREC (CSIC-UCLM-JCCM), 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Oklahoma State University

Neste artigo

Resumo

Aqui, o peixe-zebra (Danio rerio) é usado como modelo para estudar reações alérgicas e respostas imunes relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS), avaliando reações alérgicas à saliva de carrapatos e ao consumo de carne de mamíferos.

Resumo

Os carrapatos são artrópodes vetores que causam doenças por transmissão de patógenos e cujas picadas podem estar relacionadas a reações alérgicas que impactam a saúde humana em todo o mundo. Em alguns indivíduos, altos níveis de anticorpos de imunoglobulina E contra o glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) foram induzidos por picadas de carrapatos. As reações anafiláticas mediadas por glicoproteínas e glicolipídios contendo o glicano α-Gal, presentes na saliva do carrapato, estão relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS) ou alergia à carne de mamíferos. O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrado amplamente utilizado para o estudo de diferentes patologias. Neste estudo, o peixe-zebra foi usado como modelo para o estudo de reações alérgicas em resposta ao consumo de carne de α-Gal e mamíferos porque, assim como os humanos, eles não sintetizam esse glicano. Para isso, foram avaliados os padrões comportamentais e as reações alérgicas do tipo anafilático hemorrágico em resposta ao consumo de saliva do carrapato Ixodes ricinus e carne de mamíferos. Esta abordagem experimental permite a obtenção de dados válidos que suportam o modelo animal do peixe-zebra para o estudo de alergias transmitidas por carrapatos, incluindo a AGS.

Introdução

Os carrapatos são vetores de patógenos causadores de doenças e também são causadores de reações alérgicas, afetando a saúde humana e animal em todo omundo1,2. Durante a alimentação do carrapato, biomoléculas presentes na saliva do carrapato, especialmente proteínas e lipídios, facilitam a alimentação desses ectoparasitas, evitando as defesas do hospedeiro3. Algumas biomoléculas salivares com modificações no glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) levam à produção de altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE após a picada do carrapato, apenas em alguns indivíduos, o que é conhecido como Síndrome de α-Gal (AGS)4. Trata-se de uma doença associada à alergia mediada por IgE que pode resultar em anafilaxia a picadas de carrapatos, consumo de carne de mamíferos não primatas e alguns fármacos, como o cetuximabe5. As reações à α-Gal são frequentemente graves e algumas vezes podem ser fatais 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

O α-Gal é encontrado em todos os mamíferos, exceto macacos do Velho Mundo, macacos e humanos que não têm a capacidade de sintetizar α-Gal13. Entretanto, patógenos como bactérias e protozoários expressam esse glicano em sua superfície, o que pode induzir a produção de grandes quantidades de anticorpos IgM/IgG anti-α-Gal e pode ser um mecanismo protetor contra esses patógenos16,17. Entretanto, a produção de anticorpos anti-α-Gal aumenta o risco de desenvolvimento de alergias anti-α-Gal mediadas por IgE 7,13. Anticorpos naturais anti-α-Gal produzidos em humanos, principalmente dos subtipos IgM/IgG, poderiam estar associados a essa modificação presente em bactérias da microbiota intestinal16. A AGS pode ser um diagnóstico clínico desafiador, uma vez que o principal método diagnóstico no momento baseia-se na história clínica de reações alérgicas tardias, especialmente associadas a alergias alimentares (isto é, prurido, urticária localizada ou angioedema recorrente à anafilaxia, urticária e sintomas gastrointestinais) e na dosagem de anticorpos IgE anti-α-Gal9. Os achados atuais sugerem que a picada de carrapato constitui um dos principais riscos no aparecimento da AGS 18,19, um aumento de 20 vezes ou mais nos níveis de IgE para α-Gal após uma picada de carrapato 19, uma história de picada de carrapato em pacientes com AGS20,21,22, a existência de anticorpos reativos a antígenos de carrapatos em pacientes com AGS 19, e que a IgE anti-α-Gal está fortemente relacionada aos níveis de IgE anti-carrapato19,23, mas mais estudos são necessários para avaliar quais biomoléculas estão realmente envolvidas.

Além disso, outro cenário possível são pacientes que apresentam fortes reações alérgicas a picadas de carrapatos e altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE, mas são tolerantes ao consumo de carne de mamíferos12. Portanto, a alergia à carne de mamíferos pode ser um tipo particular de alergia relacionada à picada de carrapato. As principais espécies de carrapatos associadas à AGS incluem Amblyomma americanum (EUA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Japão), Ixodes holocyclus (Austrália) e Ixodes ricinus (principal vetor da borreliose de Lyme na Europa)11,24.

O único modelo que tem sido utilizado para avaliar a produção de IgE relacionada a picadas de carrapatos é o modelo de camundongos geneticamente modificados com o gene para camundongos knocked out de α−1,3-galactosiltransferase (α-Gal KO)25,26, pois, assim como outros mamíferos, camundongos também expressam α-Gal em proteínas e lipídios e não produzem IgE para α-Gal. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo útil para pesquisas biomédicas aplicadas a mamíferos porque compartilha muitas semelhanças anatômicas com mamíferos e, como os humanos, também é incapaz de sintetizar α-Gal. Como o α-Gal não é produzido naturalmente em peixe-zebra, é um modelo acessível, fácil de manipular e permite um alto tamanho de amostra para o estudo de reações alérgicas relacionadas ao α-Gal.

Neste estudo, o zebrafish é utilizado como organismo modelo para caracterizar e descrever reações alérgicas locais, padrões comportamentais e mecanismos moleculares associados à resposta à sensibilização percutânea à saliva do carrapato26,27 e subsequente consumo de carne de mamíferos. Para este fim, os peixes são expostos à saliva do carrapato por injeção intradérmica e, em seguida, são alimentados com ração para cães, que contém produtos derivados da carne de mamíferos adequados para uso animal que contém α-Gal27, em seguida, possíveis reações alérgicas relacionadas são avaliadas. Este método pode ser aplicado ao estudo de outras biomoléculas relacionadas a processos alérgicos, especialmente aquelas relacionadas à AGS.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Castilla La Mancha sob o estudo "Avaliação da resposta imune à vacina inativada contra M. bovis e desafio com M. marinum no modelo de peixe-zebra número PR-2017-05-12".

Os carrapatos foram obtidos da colônia de laboratório, onde amostras representativas de carrapatos na colônia foram testadas por PCR para patógenos comuns de carrapatos para confirmar a ausência de patógenos, e mantidas no Instituto de Parasitologia, Centro de Biologia da Academia Tcheca de Ciências (IP BC CAS), República Tcheca.Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Lei de Proteção Animal da República Tcheca nº 246/1992 Sb (aprovação ética nº 34/2018).

1. Tratamento de peixe-zebra

NOTA: O ensaio é projetado para avaliar reações alérgicas e a resposta imune em peixes-zebra tratados com saliva de carrapato em resposta ao consumo de carne de mamíferos.

  1. Tratar os peixes (conforme explicado na secção 4) com saliva de carrapato, comercial Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (ver Tabela de Materiais), utilizado como controlo positivo, com solução salina tamponada com fosfato (PBS) como controlo negativo. O peixe-zebra adulto é distribuído aleatoriamente em três grupos com equilíbrio entre os sexos (Figura 1).
    NOTA: Qualquer outro composto desejado relacionado com AGS pode ser avaliado usando este modelo.

2. Extração de saliva do carrapato Ixodes ricinus

  1. Use carrapatos fêmeas semi-ingurgitados livres de patógenos alimentados por 6-7 dias em cobaias.
  2. Tratar o carrapato com 5 μL de uma solução a 2% (m/vol) de cloridrato de pilocarpina em PBS (ver Tabela de Materiais) em pH 7,4 para o hemocoel usando uma seringa de 50 μL com uma agulha de 0,33 mm, como descrito anteriormente28 para induzir a produção de saliva do carrapato.
    NOTA: Os carrapatos são manipulados usando pinças; Seja cauteloso para não aplicar muita força ao agarrá-los.
  3. Coletar saliva usando uma ponta de 10 μL montada em uma micropipeta.
    1. Introduza a ponta dentro do carrapato com cuidado.
    2. Manter a saliva em um tubo de 1,5 mL sobre gelo, agrupá-la e armazená-la a -80 °C, conforme descrito anteriormente27.
  4. Determinar a concentração de proteína da saliva, para estabelecer a quantidade de proteína a ser injetada nos peixes, como em estudos anteriores27 usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA (ver Tabela de Materiais) seguindo as recomendações do fabricante.

3. Manutenção do peixe-zebra

  1. Manter o peixe-zebra em um sistema de fluxo através da água a 27 °C com um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (Figura 2).
  2. Alimentar os peixes duas vezes ao dia, às 9h30 e às 13h30, com ração seca (50-70 μg/peixe) até o dia 2.
  3. Alimentar os peixes duas vezes ao dia, às 9h30 e às 13h30, com ração seca para cães (50-70 μg/peixe) a partir do dia 2 após a injeção do tratamento até o final do experimento

4. Injeção de peixe-zebra

  1. Selecionar 10 peixes por grupo com uma proporção semelhante de fêmeas/machos e peso semelhante.
    NOTA: O grupo 1 contém peixes injetados com PBS, o grupo 2 contém peixes injetados com saliva de carrapato e o grupo 3 contém peixes injetados com α-Gal.
  2. Anestesiar brevemente os peixes por imersão em metanossulfonato de tricaína a 0,02% (MS-222) (Filme 1).
    NOTA: Peixes devidamente anestesiados apresentam respiração normal e não nadam, enquanto podem ser colocados no fundo do tanque de água ou flutuando. Cada peixe deve ser anestesiado individualmente para evitar possíveis danos fisiológicos.
  3. Capturar os peixes anestesiados usando uma rede de pesca.
  4. Coloque o peixe em sua metade de lado, usando pinça ou mãos, cuidadosamente, sobre uma esponja molhada, com a nadadeira caudal do lado direito para injetar os compostos na mesma direção, a fim de controlar as lesões.
  5. Injetar grupos de peixes por via intradérmica, como em estudos anteriores26, no músculo a 5 mm da nadadeira caudal e a um ângulo de 45° em relação ao corpo do peixe (Filme 2). Utilizar o tratamento adequado nos dias 0, 3 e 8, conforme descrito anteriormente 27, com uma seringa de 100 μL equipada com uma agulha de 1 cm, 29 G com 1 μL (com 9 μg/μL de proteína) de saliva de I. ricinus em 10 μL de PBS (saliva de carrapato), 5 μg de α-Gal em 10 μL de PBS (α-Gal)27,  e 10 μL de PBS (Figura 3).
    OBS: O manuseio deve ser feito de forma rápida e cuidadosa para evitar qualquer dano físico ao animal.
    Outras biomoléculas presentes na saliva do carrapato podem ser avaliadas seguindo este protocolo.
  6. Coloque os peixes tratados de volta em um tanque de água doce sem anestesia para recuperação.
    OBS: Todos os peixes do mesmo grupo podem ser colocados no mesmo tanque de água para recuperação.

5. Alimentação de peixes-zebra

  1. Amasse a ração do cão com uma argamassa e pilão.
  2. Alimentar 50-70 μg/peixe duas vezes ao dia às 9:30 e 13:30 com ração seca até o dia 2.
  3. Alimentar 50-70 μg/peixe duas vezes ao dia às 9:30 e 13:30 com ração amassada do dia 2 após a injeção do tratamento até o final do experimento no dia 8.
    NOTA: Se forem avaliados marcadores de imunidade ou títulos de anticorpos para α-Gal ou IgE em resposta aos tratamentos ou à alimentação ao longo das diferentes inoculações, a alimentação será necessária até ao final da experiência.

6. Avaliação de reações alérgicas, lesões e comportamento em zebrafish

  1. Examinar o tipo hemorrágico de reações alérgicas (vermelhidão, descoloração e hemorragia da pele) usando uma lupa ou estereomicroscópio para precisão e indicar a localização de seu aparecimento nos peixes seguindo a categorização incluída na Tabela 1 (Figura 4A).
    OBS: As reações alérgicas apresentadas na Figura 4 surgiram após a injeção de saliva de carrapato e o consumo de ração contendo carne vermelha. Portanto, as reações descritas são do tipo de reações associadas à AGS, uma vez que reações semelhantes aparecem no contexto clínico.
    1. Observe se alguma reação aparece após os tratamentos e durante a administração de alimentos duas vezes ao dia enquanto os peixes estão no tanque de água.
  2. Examinar o comportamento dos peixes avaliando as mudanças27 nos padrões de nado (mobilidade, velocidade, ficar imóvel no fundo do tanque de água e nadar em zigue-zague) seguindo a categorização incluída na Tabela 1.
  3. Avaliar a mortalidade acumulada, informando o número de peixes mortos incluindo a hora/dia da morte (Figura 4B).
    OBS: Todos os parâmetros são avaliados logo após o tratamento ou após a troca da ração e acompanhados diariamente até o final do experimento no 8º dia categorizando as variáveis qualitativas (Tabela 1). Como recomendação, essa avaliação deve ser conduzida por um profissional com conhecimento sobre peixe-zebra para considerar mudanças comportamentais com base em sua formação e experiência de trabalho com este modelo animal.
  4. Calcule o número de peixes-zebra por dia com reações alérgicas relatadas, comportamento anormal e mudanças na alimentação em cada grupo e compare entre os grupos por um teste ANOVA unidirecional.

7. Coleta de amostras

  1. Eutanásia dos peixes por imersão em MS-222 0,04% no 8º dia.
    NOTA: Coletar também as amostras dos peixes que morrem de reações alérgicas durante o ensaio.
  2. Fixe o peixe em uma placa de parafina com alfinetes.
  3. Coletar soro dos vasos sanguíneos das emalhares 29 dos peixes imediatamente após a eutanásia, quando as brânquias ainda estiverem irrigadas com sangue, usando uma seringa de 0,5 mL equipada com uma agulha de 1 cm e29 G. Conservar num tubo de 1,5 ml a -20 °C até à sua utilização (filme 3).
  4. Cortar o peixe sagitalmente com lâmina de bisturi e avaliar as lesões internas (lesões hemorrágicas ou granulomas)27,30 se elas aparecerem.
    NOTA: As lesões não aparecem necessariamente, mas devem ser registradas se aparecerem.
  5. Coletar o intestino (Filme 4) e o rim (Filme 5) de cada peixe em tubos separados vazios de 1,5 mL, conforme descritoanteriormente 31, e armazená-los a -80 C (Figura 4C).
  6. Extraia o RNA total das amostras de intestino e rim do peixe-zebra usando um kit de purificação de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Analisar a expressão de genes relacionados à resposta imune conforme descrito anteriormente30,32 (ver Tabela 2 para sequências de primers) em zebrafish, realizando uma reação quantitativa em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-qPCR) usando uma mistura de transcrição reversa para RT-qPCR (ver Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar os valores de cT de RNAm contra D. rerio GAPDH e comparar entre os grupos (peixes tratados com saliva, α-Gal e os grupos tratados com PBS) usando um teste t de Student com variância desigual.
  8. Determinar títulos de anticorpos IgM que reconheçam α-Gal em zebrafish em amostras de soro por ELISA, conforme descrito anteriormente27,30. Registrar os títulos de anticorpos como valores de 450 nm, usando um leitor de placas, e comparar entre os grupos (peixes tratados com saliva, α-Gal e os grupos tratados com PBS) usando um teste t de Student com variância desigual.
    NOTA: A determinação dos títulos de anticorpos IgM e a análise do gene de expressão são opcionais e conduzidas apenas se forem necessárias informações imunológicas. A mistura RT-qPCR é um kit de síntese de cDNA de primeira fita para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real.

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Resultados

O protocolo aqui apresentado é baseado em vários aspectos de experimentos previamentepublicados27,30 e resultados realizados em nosso laboratório onde o modelo do zebrafish é estabelecido e validado para o estudo da AGS e da resposta imune ao α-Gal, pois tanto humanos quanto zebrafish não sintetizam essa molécula13. Este modelo permite caracterizar e avaliar uma variedade de reações alérgicas como resultado da resposta do hospedeiro à sali...

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Discussão

O peixe-zebra é um modelo custo-efetivo e de fácil manuseio, que também tem sido uma ferramenta bastante viável para o estudo de mecanismos moleculares da resposta imune, doenças patogênicas, testes de novas drogas e vacinação e proteção contra infecções33,34,35. O estudo sobre o comportamento do peixe-zebra é útil, uma vez que estudos anteriores descobriram que algumas espécies de peixes permanecem imóveis no fundo do tanque qu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo SaBio por sua colaboração no projeto experimental e assistência técnica com a instalação experimental de peixes e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espanha) pelo fornecimento de peixe-zebra. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espanha e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha, bolsa IJC2020-042710-I.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 1,5 mLVWR525-0990
All Prep DNA/RNAQiagen80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit Conjunto de Disection Thermo Fisher Scientific23225
VWR631-1279
Ração para Cães - VermelhoAcana-96
wellThermo Fisher Scientific10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) Seringas de
iScript Transcrição Reversa1708840
Hamilton7638-01
Leitor de placasqualquer
solução salina tamponada com fosfatoSigmaP4417-50TAB
cloridrato de pilocarpina SigmaP6503
P10 VWR613-0364
Ponta de pipeta P1000VWR613-0359
Alimento premium peixe tropicalDAPC
Esponja Porta-animais Feito de espuma de sucata
Estereomicroscópioqualquer
termociclador PCR em tempo realqualquer
metanossulfonato de tricaína (MS-222)SigmaE10521
Pratos ELISA Classic Microlitro Supermix Supermix NGP0203 Dextra Ponta de pipeta

Referências

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