Avaliação ex vivo da função biventricular murina em modelo de Langendorff

Resumo

Apresentamos um protocolo para quantificar de forma confiável a função ventricular direita e esquerda de corações doados após preservação a frio usando um sistema de perfusão ex vivo .

Resumo

A disfunção primária do enxerto (DPE) continua sendo a principal causa de morte precoce após o transplante cardíaco. O tempo de isquemia prolongado durante a preservação do frio é um importante fator de risco para a DPE, e a avaliação confiável da função cardíaca é essencial para estudar as respostas funcionais do coração doador após a preservação pelo frio. O vídeo que acompanha descreve uma técnica para avaliar a função ventricular direita e esquerda murina usando perfusão ex vivo baseada em um modelo de Langendorff após preservação a frio por diferentes durações. Em resumo, o coração é isolado e armazenado em uma solução fria de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Em seguida, o coração é perfundido com tampão de Kreb em modelo Langendorff por 60 min. Um balão de silicone é inserido nos ventrículos esquerdo e direito, e os parâmetros funcionais cardíacos são registrados (dP/dt, relações pressão-volume). Esse protocolo permite a avaliação confiável da função cardíaca após diferentes protocolos de preservação cardíaca. É importante ressaltar que essa técnica permite o estudo de respostas de preservação cardíaca especificamente em células cardíacas nativas. O uso de corações murinos muito pequenos permite o acesso a uma enorme variedade de camundongos transgênicos para investigar os mecanismos da PGD.

Introdução

O transplante cardíaco melhora a sobrevida e a qualidade de vida em pacientes com insuficiência cardíaca terminal¹. Infelizmente, a escassez de doadores cardíacos limita o número de pacientes que poderiam se beneficiar dessa terapia e limita a capacidade dos clínicos de combinar de forma ideal doadores com receptores ^2,3,4. Além disso, o novo sistema de alocação contribuiu para tempos isquêmicos mais longos e aumentou significativamente o uso de doadores marginais desde 2018⁵. Consequentemente, a idade média dos doadores cardíacos e o tempo de isquemia estão aumentando ao longo do tempo, levando a uma maior taxa de disfunção primária do enxerto (DPE), apesar de melhorias significativas nas estratégias de preservação do ^coração6.

A DPE pode afetar os ventrículos esquerdo, direito ou ambos e continua sendo uma complicação com risco de vida que representa a principal causa de morte precoce após o transplante cardíaco. A investigação dos mecanismos da PDG e o desenvolvimento de estratégias para melhor preservação do coração são considerações importantes, dado o potencial impacto salvador de vidas em receptores cardíacos. Portanto, modelos experimentais que permitam uma avaliação robusta e confiável da função cardíaca do doador após um tempo prolongado de armazenamento são essenciais para aumentar nossa compreensão da DPE e facilitar o desenvolvimento de novas terapias. A capacidade de avaliar com precisão a função cardíaca no coração de camundongos permite o acesso a um vasto repertório de modelos murinos transgênicos que podem identificar com precisão os mecanismos de PGD.

Em estudos fisiológicos e farmacológicos, o modelo de perfusão retrógrada de Langendorff é amplamente utilizado para avaliar a função cardíaca⁷. Especificamente, o desempenho cardíaco é detectado por um balão de silicone conectado a um transdutor de pressão dentro da cavidade do ventrículo esquerdo (VE). Uma característica fundamental da DPE é a contração e relaxamento inadequados do músculo ventricular. Estudos prévios de Langendorff enfocaram o uso do balão do VE para produzir resultados confiáveis e reprodutíveis na avaliação funcional do VE 8,9,10. Entretanto, o uso do balão intracavitário para avaliar a função do ventrículo direito (VD) utilizando o sistema de balões é menos reconhecido.

Dada uma taxa significativa de DPE envolvendo o VD após o^{transplante11}, métodos experimentais para estudar a função do VE e do VD ajudariam a determinar os mecanismos moleculares e fisiológicos que contribuem para a DPE do VD. Esse protocolo mostra que o balão de silicone intracavitário pode fornecer avaliações confiáveis da função do VE e do VD no mesmo coração murino¹². Para avaliar o potencial uso do sistema de Langendorff no estudo PGD, examinamos as funções cardíacas com diferentes períodos de armazenamento e encontramos diminuição da função cardíaca em contração e relaxamento com o armazenamento refrigerado prolongado de corações murinos. Curiosamente, o VE apresenta maior redução funcional que o VD. Em resumo, o protocolo aqui descrito pode ser usado para avaliar o efeito de uma droga candidata e de vias moleculares na função do VE e do VD. A capacidade de utilizar este método em corações murinos facilitará a realização de estudos mecanísticos detalhados.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan, Ann Arbor. Todos os camundongos foram alojados em um ciclo de luz de 12:12 em salas livres de patógenos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, animais e equipamentos usados neste protocolo.

1. Construção do cateter-balão de silicone

OBS: O balão de silicone é confeccionado conforme descrito anteriormente¹³.

1. Adicionar 9,5 mL de água destilada, 14,2 mL de xarope de milho light e 33,8 g de sacarose a um copo de 100 mL. Aqueça e mexa a solução até que o açúcar esteja completamente dissolvido.
2. Prepare a massa misturando 10 g de farinha de trigo e 5 g de água até obter uma consistência uniforme e deixe descansar por 10 min.
3. Molde um pequeno pedaço de massa em um oval - a "cabeça" - e prenda-o à extremidade de um fio de espaguete seco. Em seguida, mergulhe esta cabeça na solução de açúcar e remova lentamente da solução, pois a cabeça agora está completamente revestida.
   OBS: A massa deve ser lisa e de textura uniforme. Os tamanhos de massa podem ser variados para gerar diferentes tamanhos de balões, de 5 mm (diâmetro curto) a 7 mm (diâmetro longo). Tente cobri-los com uma fina película de solução de açúcar.
4. Suspenda o fio de espaguete em um bloco de espuma de poliestireno, ou outros suportes, para formar uma cobertura brilhante uniformemente sobre a cabeça e secar durante a noite.
5. Mergulhe o molde na dispersão de silicone (elastômero de silicone disperso em xileno). Coloque o fio de espaguete de volta no bloco de espuma de poliestireno a 37 °C por 2 h ou até secar. Repita esta etapa uma vez.
   OBS: É fundamental evitar que o gel de dispersão de silicone oxide devido à exposição ao ar, pois isso irá gerar uma espessura irregular do balão.
6. Coloque o molde na água para separar e recolher o balão. Conservar o balão em azida sódica a 0,02%.
7. Corte uma ponta de duas pontas rombas de uma agulha de 22 G; montar uma extremidade romba no balão de silicone e outra extremidade romba na tubulação de polietileno. Use seda 4-0 para amarrar o balão no lugar na agulha.
   NOTA: Teste a integridade do balão injetando água nele. Uma vez que o balão está cheio, pressione o balão suavemente para testar se o balão mantém a tensão em seu interior. Use um balão novo se ele estiver vazando. Os balões montados podem ser armazenados para uso futuro.

2. Preparo do sistema de perfusão cardíaca

1. Fazer 1 L de tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KH) e transferi-lo para o reservatório de água do sistema Langendorff.
2. Conecte o tubo de ar ao reservatório de água e ligue o fluxo de ar para equilibrar o tampão KH com 5% CO 2 e 95% O₂ por pelo menos 30 min.
3. Coloque o banho-maria a 41,5 °C e circule a água na camada externa do sistema Langendorff para aquecer o sistema e o tampão KH.
   NOTA: A temperatura do banho-maria requer otimização para cada sistema. Para este sistema, a temperatura do banho-maria manterá o KH em 37-37,5 °C ao perfundir no coração.

3. Isolamento, montagem e canulação do coração do rato

1. Para anticoagulação, administrar 200 unidades de heparina em solução salina por injeção intraperitoneal (i.p.) no quadrante direito do abdome de camundongos C57/B6. Aspirar a seringa antes da injeção para confirmar se o bisel das agulhas não está na bexiga ou no lúmen do trato gastrointestinal. Use pelo menos quatro camundongos em cada condição experimental (mas também considere o tamanho do efeito do tratamento).
   1. Após 30 minutos, administrar 80 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina i.p. para anestesiar o camundongo. Verifique se o rato anestesiado está inconsciente, realizando uma pinça do dedo do pé e garantindo que nenhuma resposta seja observada. A acepromazina 2mg/kg pode ser adicionada ao cocktail ket/xyl se a estirpe utilizada de ratinhos não atingir um nível adequado de anestesia apenas com ket/xyl.
   2. Faça uma incisão logo abaixo do esterno. Use uma tesoura para abrir o peito, cortando o diafragma e as costelas. Dobre a parede torácica anterior para expor totalmente o tórax. Corte na aorta descendente (fechada ao arco da aorta). Transfira o coração, os pulmões e o timo do camundongo para o tampão frio histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Isole os órgãos sob tampão HTK gelado. Expor a aorta, removendo quaisquer tecidos conjuntivos.
      NOTA: Maximizar o comprimento da aorta incluindo a aorta ascendente e a região do arco aórtico na excisão para permitir espaço suficiente para se conectar a uma agulha.
2. Conecte a extremidade da aorta a uma agulha de 22 G e amarre com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se de que a cânula esteja acima da raiz da aorta para não interferir com a válvula aórtica. Perfundir a aorta com 10 mL de tampão HTK frio (4 °C) por aproximadamente 10 min.
   NOTA: Leva menos de 15 minutos desde a remoção do coração até a canulação da aorta; Entretanto, é importante manter a velocidade de perfusão no nível adequado. Injeções muito rápidas e vigorosas podem gerar altas pressões e causar danos vasculares/cardíacos.
3. Armazenar o coração em um tubo de 50 mL com HTK gelado por 8 h ou realizar imediatamente a perfusão (não armazenar o controle) e evitar o contato direto com gelo.
   NOTA: O contato direto do tecido cardíaco com gelo pode levar à lesão pelo frio.
4. Conecte o coração montado na agulha à cânula no aparelho de Langendorff e amarre-o com uma sutura de seda.
   OBS: Para padronizar o procedimento, aguardar um total de 3 min para o processo de canulação antes da perfusão.
5. Iniciar a perfusão com fluxo constante a 3 mL/min; em seguida, mude para o modo de pressão constante em 70-80 mmHg e ajuste o coração para ~6 mL/min.
   NOTA: Palpar o coração suavemente pode ajudar a acelerar a reanimação cardíaca. Se o fluxo de perfusão for muito maior que 6 mL/min no modo de pressão constante, pode haver um vazamento na canulação ou a válvula aorta pode não estar funcionando adequadamente. Ajuste as conexões para corrigir o vazamento. O modo de fluxo constante substitui a auto-regulação do tônus vascular do coração. O modo de pressão constante permite que o coração regule seu fluxo de perfusão coronariana. Portanto, o modo de pressão constante medirá precisamente a função cardíaca e a qualidade de preservação do coração.
6. Conecte um balão desinsuflado e cheio de água a um transdutor de pressão e a uma seringa cheia de água com uma torneira de três vias. Após um período de equilíbrio de 15-20 min, cortar o átrio direito (AD) e inserir o balão no VD através do AD. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do VD. Minimize a área aberta do AR para ajudar a restringir o balão no ventrículo (consulte a Figura 1 para a configuração).
   NOTA: Um período de equilíbrio é necessário, pois a contração e o relaxamento cardíacos não são estáveis no início, e a medida é menos precisa e representativa. Se o nó AV for danificado durante a abertura do AR, o coração exibirá arritmias frequentes.
7. Após 20 min da coleta dos dados funcionais do VD, cortar o átrio esquerdo (AE) e inserir um balão desinsuflado cheio de água no VE através do AE. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do LV.
   OBS: O coração deve manter hemodinâmica estável por mais de 1,5 h.

4. Registro de dados funcionais

1. Calibração do transdutor de pressão
   1. Encha uma seringa de 10 mL com soro fisiológico morno e conecte a seringa à cúpula através de uma torneira de três vias. Abra a torneira e encha lentamente a cúpula com soro fisiológico e, em seguida, feche todas as torneiras e remova a seringa. Fixar a cúpula preenchida ao transdutor; Conecte o manômetro à terceira extremidade do torneiro de três vias.
   2. No software de gravação, selecione o Bridge Amp no menu suspenso do canal que se conecta ao transdutor. Renomeie o canal como Pressão perfundida. Clique em Zero para zerar o transdutor.
   3. Inicie a gravação clicando em Iniciar para que o transdutor esteja agora lendo 0 mmHg. Após vários segundos de gravação, empurre lentamente a seringa e aumente a pressão para 100. Clique em parar para interromper a gravação.
   4. Na caixa de diálogo Conversão de unidades, selecione uma área de gravação para 0 mmHg e clique na seta para Ponto 1 e digite 0 mmHg. Selecione a área de gravação para 100 mmHg, clique na seta para o Ponto 2 e digite 100 mmHg. Clique em OK para calibrar o transdutor.
2. Renomeie o canal correspondente ao transdutor de pressão com o balão como pressão ventricular. Inicie a gravação quando o coração estiver conectado ao sistema. Após a inserção do balão no ventrículo, ajuste o volume de água no balão usando uma seringa micrométrica através da torneira de três vias para manter a pressão diastólica final em 5-10 mmHg.
   OBS: A medida diastólica final pode diminuir durante a medida, preferencialmente iniciando em torno de 10 mmHg.
3. Renomeie um canal vazio como dP/dt. No menu suspenso, selecione Derivada | canal de origem como Pressão do ventrículo. O canal registrará a relação de mudança de pressão na cavidade ventricular durante o período de contração.
4. Selecione um período estável de medida e clique em Configuração no módulo Pressão arterial.
   1. Selecione a pressão ventricular como canal de entrada e clique na seleção para um período de cálculo | Está bem.
   2. Clique em Modo de exibição do classificador para remover o ciclo cardíaco atípico (por exemplo, tempo ou pressão de ciclo anormal).
   3. Clique em modo de exibição de tabela para gerar as tabelas da média de max dP/dt (contração) e min dP/dt (relaxamento) para o período selecionado.
      NOTA: Armazene o arquivo de gravação para cada amostra e salve a tabela de função cardíaca média para análise estatística.

Resultados

Corações adultos de camundongos C57Bl/6, com 3 meses de idade, foram colhidos e montados no sistema Langendorff. O coração doador foi armazenado em HTK por 0 e 8 h e, em seguida, perfundido com tampão KH oxigenado. Um balão de silicone conectado a um transdutor de pressão foi usado para medir a contração e o relaxamento da função do VE e VD.

As pressões aórticas foram mantidas na faixa de 70-80 mmHg. A frequência cardíaca foi comparável em corações de camundongos com 0 e 8 h de armazenamento. As funções do VE e VD foram examinadas medindo-se as pressões sistólica e diastólica. dP/dt, uma derivada para calcular a razão de variação de pressão, foi calculada para determinar a dinâmica da pressão. O número absoluto de dP/dt máx e dP/dt min poderia representar o nível de contração e relaxamento muscular. Em 0 h de armazenamento, o VE apresentava maior pressão sistólica em relação ao VD (Figura 2C e Figura 3A). O VE apresentou maior contração e relaxamento muscular que o VD após perfusão de 0 h de armazenamento (Figura 2C e Figura 3B,C). Entretanto, após 8 h de armazenamento refrigerado, tanto o VE quanto o VD apresentaram redução funcional significativa em relação a 0 h basal (Figura 2A-D e Figura 3B,C). As quedas da contração cardíaca foram mais acentuadas no VE. Após 8 h de armazenamento, a contração e relaxamento do VE foi de 25,1% e 30,7% do valor basal de 0 h, enquanto o VD apresentou 32,5% e 29,1% de função em relação ao basal de 0 h (Figura 3B,C). Esses resultados mostraram que a DPE do VE após armazenamento prolongado teve uma redução da contração cardíaca mais significativa do que o VD.

Figura 1: Montagem e canulação do coração do camundongo . (A) Configuração geral do setup de perfusão. 1. Reservatório de perfusão. 2. Câmara de oxigenação. 3. Câmara de armadilha de ar. 4. Câmara cardíaca. 5. Interruptor de valor para fluxo e pressão constantes. 6 e 7. Entrada de oxigênio. (B) Corações canulados com o VD à frente. (C) Posição do VD a cortar para abertura de sua cavidade. (D) Bata o tubo do balão com a cânula. Abreviação: VD = ventrículo direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparando a função do VE versus VD. (A) Registro do traçado de dP/dt máx e mínima no VD e VE no coração doador com 0 h de armazenamento. (B) O registro de dP/dt máx e mínima no VD e VE no coração doador com 8 h de armazenamento. (C,D) Detalhes de dP/dt, pressão do VE, frequência cardíaca e pressão de perfusão no VE e VD em 0 h e 8 h. Abreviações: VD = ventrículo direito; VE = ventrículo esquerdo; dP/dt = relação pressão-tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação da função do VE versus VD após armazenamento e perfusão. (A) Pressão sistólica e diastólica do VE e VD após 0 h e 8 h de armazenamento. (B) dP/dt máx e (C) dP/dt mínima do VE e VD após perfusão com 0 h e 8 h de armazenamento. Esse dado é de Lei et ^al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo descreve o método de Langendorff de perfusão retrógrada via canulação aórtica. Essa técnica pode ser utilizada para avaliar a função do VE e VD de corações murinos após armazenamento refrigerado. Os resultados mostram que o armazenamento refrigerado prolongado dos corações doados leva à redução da função cardíaca tanto no VE quanto no VD por meio desse protocolo.

Os estudos de rejeição aguda e crônica após transplante cardíaco enfocam amplamente a^{imunobiologia14}. Os efeitos das células nativas sobre o PGD durante o armazenamento refrigerado são menos bem examinados. A DPE ocorre em ~10%-20% dos transplantes cardíacos e é responsável por 66% da morte precoce dentro de 30 dias após o transplante. Em particular, a incidência de DPE afetando o VE versus o VD difere após o transplante¹¹. Sem a contribuição das respostas celulares receptoras, este método ex vivo concentra-se nas contribuições das células cardíacas nativas para a DPE após a preservação fria dos corações doados. Estudos futuros podem incorporar respostas do receptor em um modelo de transplante cardíaco murino.

Nesse protocolo, a perfusão de Langendorff de corações doadores preservados a frio enfocou as respostas cardíacas nativas à perfusão de cristaloides quentes, sem infiltração da imunidade celular. Para alcançar resultados reprodutíveis, várias etapas críticas foram padronizadas. Os corações de camundongos foram parados com solução HTK e armazenados em HTK gelado, semelhante à prática clínica. O volume de perfusão e o tempo de infusão da solução HTK para cada coração foram monitorados de perto com um temporizador. O coração doador foi mantido em tubos pré-resfriados sobre gelo contendo HTK em uma sala de 4 °C. O tempo de canulação foi padronizado para ~3 min antes da perfusão. Todos esses passos garantiram que o tempo de preservação do frio fosse a principal variável do estudo.

Um período de contratilidade cardíaca irregular por ~20 min foi comumente observado no início da perfusão. Esse período de equilíbrio e recuperação foi facilitado pelo aquecimento gradual e oxigenação dos tecidos cardíacos. Um período relativamente estável era esperado após os 20 min iniciais. O balão foi inserido na cavidade ventricular ~18 min após o período de equilíbrio inicial. Iniciamos o registro hemodinâmico após o coração estar estável por ~25 min, uma vez que o balão foi inserido. A perfusão com tampão KH manteve o desempenho cardíaco estável por ~1,5-2 h. Optou-se, portanto, por registrar hemodinâmica por 20 min em cada um dos ventrículos esquerdo e direito.

Existem várias limitações da perfusão retrógrada para o estudo da DPE dos corações após armazenamento refrigerado. Primeiro, devido ao tamanho do balão e à falta de espaço em cada cavidade ventricular (em particular, o VD), a inserção simultânea de dois balões no VE e VD é muito desafiadora. Assim, medimos a função do VD e do VE sequencialmente. É importante ressaltar que o septo interventricular contribui significativamente para a função ventricular esquerda e direita. O septo contribui com ~50% da função ventricular direita, havendo dependência interventricular¹⁵. Também é importante notar que, enquanto os procedimentos para reperfusão do coração murino no dispositivo de Langendorff levam ~3 min, o implante cirúrgico do coração humano no campo cirúrgico relativamente quente leva ~45 min. Em comparação, o coração murino neste sistema de Langendorff incorre em menor tempo isquêmico. Isso deve ser levado em conta ao considerar a tradução clínica.

Como usamos tampão KH para perfundir o coração sem sangue, isso também pode ter menos eficiência na entrega de oxigênio. Entretanto, a função cardíaca é relativamente estável através das 1,5-2 h iniciais de perfusão, permitindo medidas hemodinâmicas confiáveis. Infelizmente, atualmente não existem modelos viáveis de perfusão cardíaca para esses corações murinos menores, e o efeito da carga ventricular não pode ser avaliado nesse sistema. Apesar disso, o sistema de perfusão é altamente reprodutível, menos trabalhoso e demorado do que os modelos de transplante. Também é menos dispendioso do que os estudos de transplante, o que pode torná-lo mais adequado para o rastreamento de diferentes opções terapêuticas e várias vias moleculares. Com modificações nas soluções de preservação pela adição de fármacos candidatos, essa plataforma pode ser utilizada para avaliar os efeitos de agentes farmacológicos na redução da DPE tanto no VE quanto no VD.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sutura de seda 4-0	Braintree Scientific	SUTS108
6-0 Sutura de seda	Braintree Scientific	SUTS104
Farinha multiuso	Kroger
BD Uso geral e precisãoAgulhas hipodérmicas Glide 22 G	Seringa Fisher scientific	14-826-5A
BD com pontas Luer-Lok (sem agulha)	Fisher scientific	14-823-16E
Xarope de Milho	Kroger
Custodiol HTK Solution	Essential Pharmaceuticals LLC
Tesoura de Dissecação	Instrumentos de Precisão Mundial	14393/14394
Falcon 50 mL tubos cônicos	Fisher scientific	14-959-49A
Heparina sódio sal de mucosa intestinal suína	Sigma	H4784
Krebs Henseleit buffer	Sigma	K3753
Nusil dispersões de silicone	Avantor
	Radnoti	130101BEZ
PowerLab	ADInstruments	PL3508
Azida de sódio	Sigma	S2002
Bicarbonato de sódio	Sigma	S5761
Sacarose	Sigma	S0389
Sacarose	Sigma	S0389
Xylazine	Sigma	X1126