Artigo de método

Técnica Modificada para Constrição Aórtica Transversa em Camundongos

DOI:

10.3791/64386

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18 de agosto de 2022

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1Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Hubei Key Laboratory of Genetics and Molecular Mechanism of Cardiological Disorders, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve uma técnica modificada e simplificada com procedimento minimamente invasivo de constrição transversa da aorta (TAC) utilizando um afastador de fabricação própria. Esse procedimento pode ser realizado sem ventilador ou microscópio e introduz sobrecarga pressórica, eventualmente levando à hipertrofia cardíaca ou insuficiência cardíaca.

Resumo

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A constrição aórtica transversa (TAC) é uma cirurgia frequentemente utilizada em pesquisas sobre insuficiência cardíaca e hipertrofia cardíaca baseada na formação de sobrecarga pressórica em modelos murinos. O principal desafio desse procedimento é visualizar claramente o arco aórtico transverso e bandear com precisão o vaso-alvo. As abordagens clássicas realizam toracotomia parcial para exposição do arco aórtico transverso. No entanto, é um modelo de tórax aberto que causa um trauma cirúrgico bastante grande e requer um ventilador durante a cirurgia. Para evitar traumas desnecessários e simplificar o procedimento operatório, o arco aórtico é abordado pela proporção proximal do esterno, atingindo e ligando o vaso-alvo com um pequeno afastador de fabricação própria que contém uma alça. Este procedimento pode ser realizado sem entrar na cavidade pleura e não precisa de um ventilador ou operação microcirúrgica, o que deixa os ratos com padrões respiratórios fisiológicos, simplifica o procedimento e reduz significativamente o tempo de operação. Devido à abordagem menos invasiva e menor tempo de operação, os camundongos podem sofrer menos reações de estresse e se recuperar rapidamente.

Introdução

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A insuficiência cardíaca é um sintoma clínico complexo que resulta do comprometimento da estrutura e função do enchimento ventricular ou ejeção de sangue1. O estágio da doença é definido principalmente pela classificação de função da New York Heart Association baseada na gravidade dos sintomas e na atividadefísica2. Para aqueles pacientes com fração de ejeção acima de 50%, anormalidades estruturais e/ou funcionais elevaram peptídeos natriuréticos para apoiar o diagnóstico de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP)2. A cardiopatia isquêmica é uma das principais causas entre as múltiplas etiologias da insuficiência cardíaca. Assim, o modelo de infarto do miocárdio (como a ligadura coronária permanente) é frequentemente utilizado para estudar a fisiopatologia após hipoperfusão cardíaca ou lesão de isquemia-reperfusão 3,4. Além da lesão miocárdica aguda, outros fatores de risco como hipertensão, diabetes, obesidade e história familiar de cardiomiopatia também contribuem para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Após o paciente passar do estágio A (risco de insuficiência cardíaca) e entrar no estágio B (pré-insuficiência cardíaca), ocorre a modificação estrutural1. Por exemplo, pacientes hipertensos passam primeiro por hipertrofia adaptativa do ventrículo esquerdo e, em seguida, gradualmente evoluem para hipertrofia cardíaca desadaptativa e transitam para insuficiência cardíaca por meio do remodelamento patológico5.

Como estágio terminal de várias doenças cardiovasculares, a insuficiência cardíaca crônica vem sendo estudada hádécadas6. Múltiplos modelos murinos têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre insuficiência cardíaca, incluindo infusão de drogas (angiotensina II), distúrbios metabólicos (diabetes ou dieta hipercalórica) e constrição aórtica7. Dentre esses modelos, a perfusão da angiotensina II é acompanhada de vários efeitos colaterais em órgãos, como nosrins7. Induzir distúrbios metabólicos geralmente requer um período bastante longo de tempo. A constrição da aorta ascendente tem sido considerada de relevância limitada para a doença humana7.

O TAC é um modelo confiável que aumenta a pós-carga e induz hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca8. O modelo de TAC de tórax aberto foi descrito pela primeira vez por Rockman e col. e foi utilizado em inúmeros laboratórios ao redor do mundo9. No entanto, esse procedimento clássico de TAC causa um trauma bastante grande em camundongos e altera seu comportamento normal, o que pode levar um longo tempo de recuperação e atrapalhar o tratamentoposterior10. Outros procedimentos modificados de TAC de tórax fechado reduziram alguns passos invasivos, mas exigiram habilidades microcirúrgicas ou ventilação mecânica10,11.

O presente protocolo detalha um passo a passo com abordagem minimamente invasiva do arco aórtico utilizando afastador autoconfeccionado através de incisão mediana de 3 mm na borda superior do esterno. Esse modelo não necessita de habilidade microcirúrgica, ventilação mecânica ou corte das costelas, proporcionando uma maneira rápida, limitada ao trauma cirúrgico, descomplicada e barata de realizar a cirurgia de TAC.

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Protocolo

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O protocolo atual é aprovado pelo comitê de ética do Hospital Tongji, Faculdade de Medicina de Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, Wuhan, China. Este procedimento é realizado em camundongos adultos machos C57/BL6 (>10 semanas de idade). Todos os instrumentais cirúrgicos foram esterilizados em autoclave no pré-operatório.

1. Preparo do instrumental cirúrgico

  1. Prepare uma seringa de 5 mL e aperte a ponta da agulha com um suporte para agulha para embotá-la.
  2. Prepare uma agulha de 27 G e embote-a com um suporte para agulhas. Cortar a ponta da agulha com tesoura oftálmica é uma maneira alternativa de embotar a agulha.
  3. Dobre a ponta da agulha de 27 G 90°.
    OBS: Esta agulha será utilizada como espaçador para amarração com a aorta para constrição do vaso.
  4. Use um fio de ferro obtido comercialmente (grau médico, 0,5 mm de diâmetro, ver Tabela de Materiais) e um fio ao redor da agulha (Figura 1A). Formar uma pequena alça ou laço na ponta romba da agulha (Figura 1B).
    NOTA: Este instrumento reutilizável atua como um afastador especial de fabricação própria e permite passar sutura de seda sob a aorta nos últimos passos.
  5. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia (incluindo o afastador especial feito acima) para esterilizá-los.

2. Preparação dos animais

  1. Anestesiar o rato através de injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital sódico (50 mg/kg, ver Tabela de Materiais) de acordo com o peso corporal. Injetar localmente 100 μL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea na área cirúrgica.
  2. Confirme se o rato está totalmente anestesiado apertando o dedo do rato com a ponta da pinça.
  3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  4. Retire os pelos da garganta e parte superior do peito com creme depilatório ou um cortador.
  5. Desinfetar a área sem pelos com três esfoliantes alternados de iodo e etanol 70% em círculos concêntricos movendo-se para fora.
  6. Coloque o rato na posição supina sobre uma almofada de aquecimento coberta com um pano estéril com a cabeça apontada para o operador. Fixar as extremidades com fita adesiva e incisivos com sutura 4-0 (Figura 2A).
  7. Insira uma sonda retal (consulte Tabela de Materiais) para monitorar a temperatura corporal durante a operação. Manter a temperatura corporal em 37 °C durante toda a operação.
  8. Coloque um par de luvas estéreis.
    NOTA: Uma vez colocadas as luvas estéreis, não toque em outras áreas ou objetos não esterilizados.
  9. Corte um orifício (1-1,5 cm de diâmetro) em um novo pano estéril descartável com tesoura oftálmica esterilizada. Coloque o pano estéril sobre o mouse e certifique-se de que o campo de operação sem pelos seja visível através do orifício.
    NOTA: Esta etapa permite que o operador evite tocar em outras áreas não esterilizadas, o que ajuda a manter as condições estéreis durante a cirurgia.

3. Constrição da aorta transversa

  1. Realizar incisão vertical de 1,5 cm na pele ao nível da incisura esternal (Figura 2B) com lâmina de bisturi. Expandir a incisão da pele até o nível do ângulo esternal.
    NOTA: A incisura supraesternal é uma incisura localizada na borda superior do manúbrio esternal. É um símbolo de superfície que pode ser detectado quando os pelos de camundongos são removidos (Figura 2B). O ângulo esternal é a articulação entre o manúbrio esterno e os corpos esternos. Quando exposto o esterno, apresenta-se como uma linha branca horizontal sobre o esterno no mesmo nível da costa secunda (Figura 2C).
  2. Separe cuidadosamente a pele e a fáscia superficial e exponha a traqueia e o esterno proximal. Realizar cuidadosamente uma incisão longitudinal longitudinal de 3-4 mm na linha média do esterno a partir da borda superior até o ângulo esternal (Figura 2D).
    NOTA: O corte não deve exceder o ângulo esternal, pois há risco de causar pneumotórax agudo no camundongo.
  3. Levante suavemente o esterno com pinça e o timo e arco aórtico abaixo dele. Use cuidadosamente pinças retas e disseque sem rodeios o vaso-alvo e os tecidos ao seu redor.
  4. Segure o afastador de fabricação própria (passo 1.4) que continha uma alça de arame na extremidade da mão direita do usuário.
  5. Passar cuidadosamente a armadilha do afastador autoconfeccionado sob a aorta entre a artéria carótida comum esquerda e a origem da artéria inominada direita (Figura 2E).
  6. Passe o afastador de fabricação própria para a mão esquerda para poupar a mão direita para outros instrumentos.
  7. Com uma pinça microscópica na mão direita, passe uma sutura de seda 7-0 através da alça da alça na extremidade e puxe o afastador. Isso permitirá deixar a sutura de seda ao redor da artéria para posterior ligadura (Figura 2F).
    NOTA: Seja gentil e não arraste muito o arco aórtico de sua posição original.
  8. Coloque uma agulha 27G paralela à aorta e amarre a sutura ao redor da agulha e da aorta (Figura 2G,H).
    NOTA: O procedimento simulado deve ser o mesmo, exceto que não há ligadura da aorta.
  9. Segure a agulha 27 G com pinça oftálmica e outra pinça segurando o nó amarrado à agulha 27 G e à aorta. Retire a agulha 27 G da ligadura de forma rápida, mas suave (Figura 2H).
    NOTA: O nó não deve ser muito apertado, ou não será fácil puxar a agulha. Tenha cuidado ao puxar a agulha em caso de ruptura da aorta.
  10. Sutura da pele com fio sintético monofilamentar 4-0 em padrão de sutura interrompida (Figura 2I).

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Coloque o mouse em uma almofada quente (consulte Tabela de Materiais) e aguarde até que ele reaviva. Geralmente, o rato revive em cerca de 60 min.
    NOTA: O animal não deve ser deixado sozinho até que recupere a consciência suficiente para o decúbito esternal principal.
  2. Injetar 0,5 mL de solução salina aquecida por via subcutânea e monitorar a homeostase hídrica dos animais.
    NOTA: Esta etapa evita que os animais sofram desidratação e estado de circulação hipovolêmico.
  3. Aplique pomada de eritromicina na superfície da ferida todos os dias por 3 dias.
  4. Para o tratamento da dor pós-cirúrgica, administrar 1 mg/L de anestésico local de buprenorfina por via parenteral no local da incisão (ver Tabela de Materiais).
  5. No pós-operatório, monitore o camundongo em busca de sinais de infecção e comprometimento (desnutrição, postura curvada e pelos babados).
    OBS: Os animais que passaram por cirurgia não são devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

5. Ultrassonografia

  1. Confirmar o sucesso da ligadura da aorta transversa calculando a velocidade do fluxo sanguíneo através de um sistema de imagem de ultrassom12,13 (24 MHz, ver Tabela de Materiais) 28 dias após a cirurgia.
    1. Anestesiar o animal com isoflurano a 4,5% em ar enriquecido com oxigênio a 20% e manter com isoflurano a 0,5% em ar enriquecido com oxigênio a 20%.
    2. Coloque o mouse em decúbito dorsal e fixe suas extremidades ao eletrodo com fita adesiva.
    3. Usando creme depilatório, remova os pelos do peito e aplique um agente de acoplamento ultra-sônico no peito.
    4. Incline a plataforma para a esquerda o mais longe possível. Ao manter a sonda na posição vertical, abaixe-a gradualmente ao longo da linha paraesternal direita no tórax com o entalhe apontando para o queixo do animal.
    5. No modo B do instrumento, ajuste os eixos X e Y até que o arco aórtico e o local de constrição estejam claramente visíveis.
    6. Clique no botão Pulse Wave Doppler para alternar para o modo de onda de pulso.
    7. Ajuste a caixa de volume de amostra do cursor tracejado distal ao local contraído e encontre o jato estenótico com a maior velocidade.
    8. Clique no botão Doppler de onda de pulso novamente para obter a forma de onda do fluxo aórtico e medir a velocidade de pico. Calcular a velocidade do fluxo sanguíneo de acordo com o pico dos padrões de onda (Figura 3A,B).
    9. Defina o imageador para o modo B. Repouse a plataforma na posição horizontal. Gire a sonda 30° para a linha paraesternal esquerda.
    10. Ajuste os eixos X e Y para obter uma visualização de eixo curto. Pressione o modo M para mostrar a linha do indicador e clique em Cine Store para salvar a imagem para posterior medição da espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e fração de ejeção.
      NOTA: A fórmula para calcular a fração de ejeção: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). A fórmula para calcular o débito cardíaco: Volume sistólico * Frequência cardíaca (no primeiro quadro desenhado) / 1000. A maioria dos índices, como fração de ejeção e débito cardíaco, pode ser medida automaticamente através do software do sistema de imagem ultrassônico. Vol;d do VE: volume diastólico do ventrículo esquerdo. Vol;s do VE: volume sistólico do ventrículo esquerdo.

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Resultados

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Após cirurgia de TAC com sucesso, a sobrecarga de pressão foi detectada usando um sistema de imagem de ultrassom. Quatro semanas após a cirurgia, os ratos desenvolvem diminuição da função cardíaca. No presente estudo, a eficácia da cirurgia de TAC foi validada por meio da fração de ejeção (FE), fração de encurtamento (EF), massa ventricular esquerda (massa do VE) e diâmetro interno do ventrículo esquerdo (LVID) de camundongos submetidos à cirurgia de TAC após 4 semanas. A FE foi significativamente reduzida em ca...

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Discussão

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A indução de sobrecarga pressórica sustentada pode gradualmente causar hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Esse modelo tem sido utilizado em inúmeros laboratórios ao redor do mundo14,15,16. O protocolo proporcionou um método de TAC aprimorado que não necessita de habilidades microcirúrgicas ou ventilação mecânica.

O passo mais importante nesse protocolo é a passagem da sutura de seda sob o ...

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Divulgações

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Os autores declararam não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho é financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC 81822002). Agradecemos a todos os membros que participaram deste trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4-0 sutura não absorvívelJinhuanHM403Usado para suturar a pele
seringa de 5 mLHaifuda Technology Co., Ltd.BD-309628Usado para fazer laço contendo retractor
7-0 sutura não absorvívelJinhuanHM701Usado para ligadura da aorta
Monitor de temperatura animalKaerwenFT3400Usado para monitorar a temperatura corporal
Buprenorfina SigmaB-044Usado para tratamento de dor pós-cirúrgica
Creme depilatório VeetN / AUsado para remover pêlos do corpo da área cirúrgica
Almofada de aquecimentoXiaochuangxinN / AUsado para manter a temperatura corporal
IbuprofenoMCEHY-78131Usado para tratamento pós-cirúrgico da dor
Fio de ferro (0,5 mm)Qing YuanFio de ferro # 26Usado para fazer laço contendo retrator
Pinças microscópicasRWDF12006-10Usado para penetrar e separar o tecido para abrir o espaço de operação
Porta-agulhaRWDF12005-10Usado para beliscar a ponta da agulha de calibre e embotá-la
Pinça oftálmicaRWDF14012-10 Usado para segurar a pele e outros tecidos
Tesoura oftálmicaRWDS11001-08Usado para fazer a incisão sking do rato
Pentobarbital sódicoSigmaP3761Usado para anestesia de camundongos
Esteira de operação estérilHale & hearty211002Usado para colocar o animal durante a cirurgia
Sistema de imagem ultra-sônicaFujifilm visualsonicsvevo1100Usado para medir a velocidade do fluxo sanguíneo, espessura da parede ventricular esquerda e fração de ejeção, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100

Referências

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