Laqueadura da Artéria Coronária Esquerda: Um Modelo Murino Cirúrgico de Infarto do Miocárdio

Resumo

Apresenta-se aqui um procedimento cirúrgico para ligadura permanente da artéria coronária esquerda em camundongos. Este modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia e a resposta inflamatória associada após o infarto do miocárdio.

Resumo

A doença isquêmica do coração e o subsequente infarto do miocárdio (IM) são uma das principais causas de mortalidade nos Estados Unidos e em todo o mundo. A fim de explorar as alterações fisiopatológicas após o infarto do miocárdio e projetar tratamentos futuros, são necessários modelos de pesquisa de IAM. A ligadura permanente da artéria coronária esquerda (ACL) em camundongos é um modelo popular para investigar a função cardíaca e o remodelamento ventricular pós-IAM. Aqui descrevemos um modelo de IM murino cirúrgico menos invasivo, confiável e reprodutível por ligadura permanente da ACV. Nosso modelo cirúrgico é composto por anestesia geral facilmente reversível, intubação endotraqueal que não requer traqueostomia e toracotomia. A eletrocardiografia e a medição da troponina devem ser realizadas para garantir o IAM. A ecocardiografia no dia 28 após o IM discernirá a função cardíaca e os parâmetros de insuficiência cardíaca. O grau de fibrose cardíaca pode ser avaliado pela coloração tricrômica e ressonância nuclear magnética (RNM) cardíaca. Este modelo de IM é útil para estudar as alterações fisiopatológicas e imunológicas após o IM.

Introdução

A doença cardiovascular é uma grande preocupação de saúde pública que ceifa 17,9 milhões de vidas a cada ano, representando 31% da mortalidade global¹. O tipo de anomalia cardiovascular mais prevalente é a doença coronariana, sendo o infarto do miocárdio (IM) uma das principais manifestações da doença coronariana². O IAM geralmente é causado por oclusão trombótica de uma artéria coronária devido à ruptura de uma placa vulnerável³. A isquemia resultante causa profundas alterações iônicas e metabólicas no miocárdio afetado, bem como uma rápida diminuição da função sistólica. O IAM resulta na morte de cardiomiócitos, o que pode levar ainda mais à disfunção ventricular e insuficiência cardíaca⁴.

A pesquisa sobre IM em pacientes é limitada devido à escassez de tecidos obtidos de pacientes com IM⁵. Como tal, os modelos murinos de IAM são úteis tanto no estudo dos mecanismos da doença quanto no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos. Os modelos murinos atualmente disponíveis de IM incluem modelos de isquemia irreversível (LCA e métodos de ablação) e modelos de reperfusão (isquemia/reperfusão, I/R)⁶. A ligadura permanente da artéria coronária esquerda (ACV) em camundongos é o método mais utilizado, e imita a fisiopatologia e a imunologia do IAM em pacientes ^7,8,9. O IAM permanente também pode ser induzido por métodos de ablação, que envolvem danos elétricos ou criolesão. Os métodos de ablação são capazes de gerar infarto de tamanho uniforme no local exato¹⁰. Por outro lado, a formação de cicatrizes, a morfologia do infarto e os mecanismos de sinalização molecular podem variar entre os métodos de ablação^10,11. O método de I/R murino é outro importante modelo de IM, pois representa o cenário clínico da terapia de reperfusão¹². O modelo de I/R está associado a desafios como tamanho variável do infarto, dificuldade em distinguir respostas da lesão inicial e reperfusão⁶.

Embora amplamente utilizados, os métodos de ligadura LCA estão associados a baixas taxas de sobrevida e dor pós-operatória¹³. Este protocolo demonstra o modelo de IM cirúrgico murino de ligadura LCA que envolve o preparo e intubação de camundongos, ligadura LCA, cuidados pós-operatórios e validação de IM. Em vez de usar uma traqueostomia invasiva¹⁴, este método emprega a intubação endotraqueal. O animal é entubado iluminando a orofaringe com laringoscópio, tornando o procedimento mais fácil, seguro e menos traumático¹⁵. O rato é mantido em suporte ventilatório e sob anestesia com isoflurano durante todo o procedimento. Além disso, a ecocardiografia e a coloração tricrômica de Masson são realizadas para avaliar a função cardíaca e a fibrose cardíaca após o infarto do miocárdio, respectivamente. No geral, este método fornece um modelo murino cirúrgico confiável e reprodutível de IAM que pode ser usado para estudar a fisiopatologia e a inflamação após o IAM.

Protocolo

O protocolo do presente estudo foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Pittsburgh. Oito (sham n = 4 e MI n = 4) fêmeas de 1 ano de idade de camundongos C57BL/6J pesando 24-30 g foram utilizados para esses experimentos. Aproximadamente 100% e pelo menos 80% dos camundongos sobreviveram nos primeiros 24 h e 28 dias, respectivamente.

1. Preparação e intubação endotraqueal dos camundongos

1. Pré-aqueça um esterilizador de contas (ver Tabela de Materiais) a 250 °C e coloque instrumentos cirúrgicos autoclavados nele por alguns minutos.
2. Anestesiar o rato numa câmara de indução com isoflurano a 3% e 1 L/min de oxigénio durante 5 min.
3. Garanta a profundidade da anestesia no rato, verificando a resposta a uma beliscão firme do dedo do pé.
4. Pesar o rato para estimar a dosagem do medicamento analgésico pré-operatório, buprenorfina (0,1 mg/kg). Injete a droga por via intraperitonial.
5. Apare a pele no lado esquerdo do tórax usando uma navalha elétrica.
6. Desinfete o local cirúrgico com iodopovidona e etanol a 70% em seguida, três vezes.
7. Coloque o rato na posição supina sobre uma prancha inclinada. Prenda a cabeça e os membros do rato usando um elástico preso aos incisivos superiores e fita adesiva, respectivamente. Aplique lubrificante oftálmico estéril nos olhos para evitar a secura durante a anestesia.
8. Abra a mandíbula e puxe suavemente a língua para fora da cavidade oral.
9. Identifique a abertura da laringe iluminando a orofaringe usando um laringoscópio (ver Tabela de Materiais).
10. Corte cerca de 0,5 cm de uma agulha de cateter 24 G e insira a agulha contundente no escudo de plástico. Direcione a agulha contundente com o escudo de plástico para a traqueia. Retire a agulha, deixando o escudo de plástico na traqueia.
11. Ajuste o ventilador (ver Tabela de Materiais) para uma frequência respiratória de 137 batimentos por minuto (otimizado para os ratos utilizados neste estudo) e volume corrente de 0,18 cc. Conecte os tubos do respirador ao escudo do cateter e confirme a intubação correta procurando um movimento torácico sincronizado com o ventilador.
12. Desconecte o tubo do respirador do escudo do cateter e coloque o animal na posição supina em uma placa cirúrgica pré-aquecida com temperatura controlada. Reconecte o mouse ao ventilador.

2. Ligadura permanente da artéria coronária esquerda

1. Desinfetar o local cirúrgico com iodopovidona e álcool a 70%. Aplique uma cortina estéril com um orifício de um quarto de tamanho no centro para proteger o local cirúrgico. Levante suavemente a pele usando um par de pinças e faça uma pequena incisão transversal cutânea (1,5-2 cm) ao longo da linha entre os músculos peitoral maior e menor esquerdo usando um par de tesouras cirúrgicas.
   NOTA: Tesouras foram usadas para fazer a incisão, pois fornece o controle necessário sobre a profundidade e a direção do corte.
2. Separe os músculos peitorais subjacentes com fórceps e tesouras dissecadas. Os músculos foram separados por meio de afastadores presos a elásticos.
3. Faça uma incisão no terceiro espaço intercostal com um par de micro tesouras seguindo o ângulo natural da caixa torácica. Nesta fase, extrema cautela deve ser exercida para evitar lesões no coração e nos pulmões.
4. Estique suavemente as costelas usando afastadores para expor o ventrículo esquerdo. Mova a gordura pericárdica para o lado e localize a ACV, que vai da borda do átrio esquerdo em direção ao ápice do coração.
5. Passe um 8-0 sutura de nylon sob a ACV com a ajuda de um suporte de agulha. Ligue a ACV com um nó duplo seguido por um segundo nó (nó de um cirurgião modificado).
   NOTA: O branqueamento do ventrículo inferior esquerdo confirma uma ligadura LCA bem-sucedida. Além disso, a medição de troponina, a monitorização por ECG (supradesnivelamento do segmento ST), a ressonância nuclear magnética (RNM) eco/in vivo com gma cardíaca ou imagens de microtomografia computadorizada (TC) também são aconselhadas para confirmar as lesões comparáveis do IAM.
6. Remova os afastadores e insira uma agulha de cateter 22 G na cavidade torácica. Remova a agulha, deixando a ponta do escudo de plástico na cavidade torácica. Feche a caixa torácica usando uma sutura de nylon 4-0.
7. Ligue uma seringa ao escudo de plástico 22 G e remova lentamente o excesso de ar preso na cavidade torácica, pressionando suavemente o peito para estabelecer uma pressão de ar negativa. Remova o escudo de plástico.
8. Feche a pele com uma sutura de nylon 4-0.
9. Desligue o fornecimento de isoflurano. Nesta fase, o rato está no ventilador que fornece oxigénio.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Desligue o ventilador assim que a respiração espontânea começar.
   NOTA: O procedimento leva cerca de 30-35 min por animal desde a preparação dos ratos até esta etapa.
2. Mantenha o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore-o até que esteja acordado. O animal não deve ser deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
3. Após a cirurgia, coloque o animal em uma gaiola separada e devolva-o à gaiola original com outros animais somente depois de se recuperar totalmente.
4. Monitore o mouse diariamente para qualquer sinal de dor ou desconforto.
5. Continue a injeção intraperitoneal de buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 6-8 horas por mais 2 dias após a cirurgia.

4. Avaliação Ecocardiográfica

NOTA: A ecocardiografia foi realizada para avaliar os parâmetros de insuficiência cardíaca no dia 28 após o IM.

1. Após 28 dias após a cirurgia, anestesiar os ratos com isoflurano a 3% e oxigênio a 1 L/min, aplicar lubrificante oftálmico estéril nos olhos e remover os pelos do peito usando creme de depilação. Desinfete a área do tórax com iodopovidona e etanol a 70% três vezes.
2. Fixe os ratos anestesiados sobre a plataforma de imagem (ver Tabela de Materiais) na posição supina e mantenha um nível constante de anestesia durante todo o procedimento usando um cone nasal conectado ao sistema anestésico (1%-2% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio).
3. Cole as quatro patas aos eléctrodos de ECG com gel de eléctrodos (ver Tabela de Materiais). Monitore a temperatura do animal inserindo uma sonda retal (consulte Tabela de Materiais).
4. Aplique o gel de varredura (ver Tabela de Materiais) no peito, coloque o transdutor verticalmente, abaixe-o até a linha paraesternal (paralela ao tórax) e gire 35° no sentido anti-horário para obter a visão do eixo longo paraesternal do ventrículo esquerdo.
5. Toque no botão de imagem de modo B no software de imagem (consulte Tabela de materiais) para obter uma visão completa do eixo longo do coração. Ajuste o tamanho e o brilho do portão e salve as imagens usando Save Clip ou Save Frame para medições posteriores¹⁶.
6. Mude para o modo M (modo de movimento) e coloque o eixo do modo M ao nível do músculo papilar. Ajuste o tamanho do portão e toque no botão Iniciar no modo M. Salve as imagens usando Salvar clipe ou Salvar quadro^16,17.
7. Como o processo de aquisição de imagens em modo 4D é automatizado, verifique se os sinais de ECG e respiração estão ativos (Figura 1) antes de adquirir os dados.
8. Comece a adquirir os dados no modo B. Abra o painel de digitalização 4D e inicie o motor 3D. Defina os parâmetros da imagem no painel de digitalização 4D e toque no botão Digitalizar para iniciar a digitalização. Depois de revisar as imagens na visualização 2D, carregue as imagens no modo 4D usando o botão Carregar em 4D .

Resultados

A Figura 1 demonstra os sinais representativos de ECG e respiração durante a avaliação ecocardiográfica de camundongos sham (Figura 1A) e IM (Figura 1B). A verificação dos sinais ativos de ECG e respiração é importante antes de adquirir os dados ecocardiográficos. A Figura 2 mostra a medida ecocardiográfica dos parâmetros funcionais cardíacos após 28 dias após a ligadura da ACV.

Discussão

O modelo murino de IAM está ganhando popularidade em laboratórios de pesquisa cardiovascular, e este estudo descreve um modelo de IAM reprodutível e clinicamente relevante. Este protocolo melhora o processo de ligadura LCA de várias maneiras. Para começar, evita-se o uso de anestésicos pré-operatórios injetáveis, como xilazina/cetamina ou pentobarbital sódico^14,15. Apenas a anestesia com isoflurano foi utilizada, que ajuda a aumentar as taxas de sobrevivência ani...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha de cateter 22 G	Exel INT	26741	Toracocentese
agulha de cateter 24 G	Exel INT	26746	Intubação endotraqueal
4-0 sutura de nylon	Covetrus	29263	Sutura de músculos e pele
8-0 sutura de nylon	S& T	3192	Ligadura de
vaporizadores anestésicos	Veterinário equipar	VE-6047	Suporte anestésico
Monitor de fisiologia animal Fujifilm		VEVO 3100	Monitor de frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura corporal
Solução de betadine PBS	saúde animal	11205	Antispetic
Buprenorfina	Covetrus	55175	Analgésico
Microscópio de dissecação	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Barbeador elétrico	Wahl	79300-1001M	Gel de eletrodo de barbear
	Parker Laboratories	W60698L	Gel eletricamente condutor
Etanol	Decon Laboratories	22-032-601	desinfetante
	FST	11065-07	Aço inoxidável
Gaze	Curity	CAR-6339-PK	estéril
	Satco	S4998	Cuidados pós-operatórios
Almofada de aquecimento	Kent scientific	Surgi-M	Controle de temperatura
Esterilizador de esferas quentes	Germinador 500	11503	Esterilização de instrumento cirúrgico
Isoflurano	Covetrus	29405	Anestesia
Masson’ s kit de coloração tricrômica	Thermoscientific	87019	Medição de fibrose cardíaca
Micro Agulha Titular	FST	12500-12	Aço inoxidável
Micro tesoura	FST	15000-02	Aço inoxidável
Pomada oftálmica	Dechra	Puralube Vet	Lubrificante ocular estéril
Gel de varredura	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Gel de transmissão de ultrassom aquoso
Tesoura	FST	14060-11	de Aço Inoxidável
Pequenos Animais	Modelo Penn-Century	LS-2-M	Iluminando a orofaringe
Ventilador para pequenos animais	Aparelho Harvard	557058	Suporte para ventilador
Luz cirúrgica	Cole parmer	41723	Iluminador Largura (pol): 7
Plataforma de imagem pré-clínica Vevo 3100	Ecocardiografia	Fujifilm	VEVO 3100
Software VevoLAB	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Análise de dados ecocardiográficos

LAD Pinça Lâmpada de calor Laringoscópio para