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Biochemistry

2 डी सेल कल्चर मॉडल में वर्टेपोरफिन साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए एक इन-हाउस-बिल्ट और लाइट-एमिटिंग-डायोड-आधारित फोटोडायनामिक थेरेपी डिवाइस

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64391
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2,3, 2, 3, 2, 2, 1, 1
1Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Laboratory of Cancer Drug Resistance, Federal University of Parana, 2Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Parana, 3Federal Institute of Parana

Summary

यहां, हम एक फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में दो-आयामी हेला सेल संस्कृति और वर्टेपोरफिन का उपयोग करके इन विट्रो फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) परख को सफलतापूर्वक करने के लिए एक उपन्यास, सरल और कम लागत वाले उपकरण का वर्णन करते हैं।

Abstract

यह पेपर इन विट्रो फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) परख करने के लिए एक उपन्यास, सरल और कम लागत वाले उपकरण का वर्णन करता है, जिसका नाम फोटोएसीटी है। डिवाइस को पारंपरिक प्रोग्राम करने योग्य प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), एक तरल क्रिस्टल डिस्प्ले (एलसीडी) मॉड्यूल और एक वाणिज्यिक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड से जुड़े एक प्रकाश सेंसर के एक सेट का उपयोग करके बनाया गया था। प्रोटोटाइप की बॉक्स-आधारित संरचना मध्यम घनत्व फाइबरबोर्ड (एमडीएफ) के साथ बनाई गई थी। आंतरिक डिब्बे एक साथ चार सेल कल्चर मल्टीवेल माइक्रोप्लेट आवंटित कर सकते हैं।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने दो आयामी (2 डी) संस्कृति में हेला सेल लाइन के खिलाफ फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) वर्टेपोरफिन के साइटोटोक्सिक प्रभाव का अध्ययन किया। हेला कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए वर्टेपोरफिन की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। दवा युक्त सुपरनैटेंट माध्यम को छोड़ दिया गया था, अनुयायी कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोया गया था, और दवा-मुक्त माध्यम जोड़ा गया था। इस अध्ययन में, कोशिकाओं पर वर्टेपोरफिन के प्रभाव की जांच या तो प्रकाश जोखिम के बिना या 255, 255 और 255 के लाल-हरे-नीले (आरजीबी) मूल्यों का उपयोग करके प्रकाश के लिए 1 घंटे के संपर्क के बाद की गई थी (49.1 ± 0.6 जे / सेमी2 की औसत समृद्धि)। 24 घंटे के बाद, सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन 3-(4,5-डाइमिथाइल-2-थियाज़ोलिल)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख द्वारा किया गया था।

प्रायोगिक परिणामों से पता चला है कि डिवाइस से प्रकाश के लिए वर्टेपोरफिन के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के संपर्क में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा मध्यस्थ तंत्र के माध्यम से दवा के साइटोटोक्सिक प्रभाव को बढ़ाता है। इसके अलावा, इस काम में वर्णित प्रोटोटाइप का उपयोग एक वाणिज्यिक पीडीटी डिवाइस के साथ परिणामों की तुलना करके मान्य किया गया था। इस प्रकार, यह एलईडी-आधारित फोटोडायनामिक थेरेपी प्रोटोटाइप पीडीटी के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

सबसे घातक गैर-संचारी रोगों में से, कैंसर समय से पहले मृत्यु का एक वैश्विक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है। यह 2020 में लगभग 10 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार था, जो दुनिया भर में छह मौतों में से लगभग एक का प्रतिनिधित्व करताहै। इसके अतिरिक्त, मल्टीड्रग प्रतिरोध (एमडीआर) घटना एक जबरदस्त सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरे का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि अनुमोदित कीमोथेरेपी प्रोटोकॉल इस नैदानिक स्थिति 2 के लिए छूट चरणों तक पहुंचने में विफलरहते हैं। कैंसर कोशिकाएं कई तंत्रों के माध्यम से कीमोथेरेपी के लिए प्रतिरोध विकसित कर सकती हैं; हालांकि, कुछ एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स - एटीपी-निर्भर एफ्लक्स पंप - के ओवरएक्प्रेशन को ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट3 के भीतर एमडीआर विकास का मुख्य कारण माना जाता है। एमडीआर के अलावा, अन्य कैंसर जटिलताओं, जैसे पुनरावृत्ति और मेटास्टेसिस, इस ऑन्कोलॉजिकल चुनौती को दूर करने के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने और सुधारने की तत्काल मांग को मजबूत करते हैं।

प्रकाश के उपचारात्मक उपयोग का अभ्यास सदियोंसे किया गया है, और फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) ठोस ट्यूमर के लिए नैदानिक रूप से अनुमोदित चिकित्सीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। पीडीटी ट्यूमर कोशिकाओं में चयनात्मक साइटोटॉक्सिसिटी को लागू करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करने के लिए प्रकाश विकिरण के बाद एक फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) के प्रशासन को जोड़ती है। यह चिकित्सीय दृष्टिकोण सर्जरी, विकिरणऔर कीमोथेरेपी सहित पारंपरिक तरीकों से बेहतर है; यह एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है जो संयोजी ऊतकों में कम साइटोटॉक्सिसिटी दिखातीहै। ट्यूमर या इसके माइक्रोएन्वायरमेंट में सीधे प्रकाश अनुप्रयोग और पीएस संचय सटीक लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करते हैं और परिणामस्वरूप, मामूली, अवांछनीय प्रणालीगत दुष्प्रभाव7 और एक ही साइट पर बार-बार उपचार की संभावना होती है। इसके अलावा, लागत अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में कम है। इसकी आशाजनक विशेषताओं के कारण, पीडीटी को एकल दोनों के लिए एक उपयुक्त विकल्प माना जा सकता है, विशेष रूप से निष्क्रिय ट्यूमर, या सहायक कैंसर उपचार7 के मामले में, और कीमोथेरेपी 8,9 से संबंधित एमडीआर के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

पीडीटी का उपयोग करके उच्च उद्देश्य प्रतिक्रिया दर दिखाने वाली पहली रिपोर्ट 1975 में माउस और चूहे मॉडल10 में वर्णित की गई थी। तब से, 2 डी सेल कल्चर11,12 में मानव ट्यूमर सेललाइनों के साथ विवो और इन विट्रो दोनों में सकारात्मक परिणामों के साथ पीडीटी का उपयोग करके अध्ययन किए गए हैं। नैदानिक रूप से अनुमोदित पीएस की व्यापक प्रयोज्यता को ध्यान में रखते हुए, उनके विशिष्ट संचय मार्गों और अवशोषण चोटियों की तरंग दैर्ध्य सीमाओं की परवाह किए बिना, सामान्य प्रक्रिया निम्नानुसार है: (i) पीएस अपटेक, (ii) ट्यूमर या उसके माइक्रोएन्वायरमेंट में पीएस एकाग्रता का चरम, (iii) प्रकाश अनुप्रयोग, (iv) पीएस-लाइट इंटरैक्शन, (वी) पीएस उत्तेजित-अवस्था ऊर्जा का ऊतक सब्सट्रेट या आसपास के ऑक्सीजन अणुओं में स्थानांतरण, (vi) आरओएस उत्पादन जिसमें एकल ऑक्सीजन या सुपरऑक्साइड आयन शामिलहैं, (vii) अनिवार्य रूप से, नेक्रोसिस या एपोप्टोसिस (प्रत्यक्ष मृत्यु), ऑटोफैगी (साइटोप्रोटेक्टिव तंत्र), ऊतक इस्किमिया (संवहनी क्षति), प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन, या इन तंत्रों के ओवरलैप के माध्यम से ट्यूमर कोशिका मृत्यु। इस अंतिम चरण में, एक विशिष्ट कोशिका मृत्यु मार्ग का सक्रियण कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे सेल विशेषताओं, प्रयोगात्मक डिजाइन और, सबसे महत्वपूर्ण बात, पीएस इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण और पीडीटी से संबंधित लक्षित क्षति13।

वर्टेपोरफिन एक दूसरी पीढ़ी का पीएस है, जिसे नॉर्वे और चीन में नैदानिक उपयोग के लिए नियामक एजेंसियों द्वारा उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन 7 के इलाज के लिए अनुमोदितकिया गया है। खुराक वितरण के बाद, इस प्रोड्रग को आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया14 में जमा होने और सेलुलर प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन और डीएनए विखंडन को प्रेरित करने की सूचना मिली, जिससे ट्यूमर सेल एपोप्टोसिस15,16 हो गया। वर्टेपोरफिन आंतरिककरण के लिए 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, 690 एनएम तरंगदैर्ध्य सेटअप का उपयोग करके एक पीडीटी प्रोटोकॉल को आसन्न अणुओं7,17 में विद्युत चुम्बकीय विकिरण हस्तांतरण के प्रभावी स्तर को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।

पीडीटी के लिए प्रकाश स्रोत के बारे में, शास्त्रीय डायोड लेजर सिस्टम आमतौर पर महंगे, तकनीकी रूप से जटिल, ओवरसाइज़्ड होते हैं, और इस प्रकार18,19। इसकी एकल-तरंग दैर्ध्य प्रोफ़ाइल के परिणामस्वरूप, जिसे एलईडी-आधारित पीडीटी उपकरणों में भी देखा जा सकता है, प्रत्येक फोटोसेंसिटाइज़र एप्लिकेशन के लिए स्वतंत्र इकाइयों की मांग डायोड लेजर सिस्टम के उपयोग को और भी जटिल और आर्थिक रूपसे अव्यावहारिक बनाती है। इसलिए, एलईडी मशीनरी के उपयोग को न केवल लागतऔर रखरखाव के मुद्दों को हल करने के लिए सबसे आशाजनक विकल्प माना जाता है, बल्कि उच्च शक्ति उत्पादन और कम हानिकारक23 और व्यापक रोशन क्षमता 24,25,26,27 प्रदान करने के लिए भी माना जाता है।

संभावित योगदान के बावजूद जो एलईडी-आधारित उपकरण पीडीटी प्रयोगों28 को पेश कर सकते हैं, अधिकांश वाणिज्यिक विकल्पों में अभी भी पोर्टेबिलिटी की कमी, उच्च लागत और जटिल निर्माण परियोजनाओं और संचालन29 जैसी कमियां हैं। इस काम का मुख्य उद्देश्य इन विट्रो पीडीटी परख के लिए एक सरल और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करना था। यह पेपर फोटोएसीटी का वर्णन करता है, जो एक इन-हाउस-निर्मित एलईडी-आधारित पीडीटी डिवाइस है, जो सस्ती, उपयोगकर्ता के अनुकूल और पोर्टेबल है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, इस उपकरण को 2 डी सेल कल्चर मॉडल में वर्टेपोरफिन की साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और इसलिए, पीडीटी प्रयोगों में एक शोध उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. डिवाइस निर्माण

  1. चित्रा 1 ए में दिखाए गए आयामों के साथ टुकड़े प्राप्त करने के लिए 3 मिमी मोटा मध्यम घनत्व फाइबरबोर्ड (एमडीएफ) देखा।
    नोट: कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) काटने के लिए वेक्टर फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करें।
  2. निम्न आयामों (लंबाई x चौड़ाई x ऊंचाई) के साथ दो बक्से बनाएँ: बड़े बक्से के लिए 330 मिमी x 235 मिमी x 225 मिमी, और छोटे बक्से के लिए 300 मिमी x 220 मिमी x 150 मीटर (चित्रा 1 बी)।
  3. बैरल जैक कनेक्टर स्थापित करने के लिए बड़े बॉक्स के पीछे ड्रिल करें। बड़े बॉक्स के शीर्ष पर ड्रिल करें और इलेक्ट्रिक केबलों के लिए एक मार्ग प्रदान करने के लिए छोटे बॉक्स के शीर्ष और नीचे को ड्रिल करें (चित्रा 1 सी)।
  4. सजातीय प्रकाश घटनाओं को बढ़ावा देने के लिए सभी आंतरिक सतहों को काली स्याही से पेंट करें (चित्रा 1 डी)।
  5. समानांतर में, छोटे बॉक्स की ऊपरी आंतरिक सतह पर प्रत्येक में 10 एलईडी के साथ तीन एलईडी टेप संलग्न करें (चित्रा 1 ई)।
  6. छोटे बॉक्स (चित्रा 1 एफ) के निचले आंतरिक सतह के केंद्र में एक चमक सेंसर स्थापित करें।
  7. 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 2) का उपयोग करके नियंत्रण इकाई (चित्रा 1 जी) की संरचना प्रिंट करें।
  8. नियंत्रण इकाई इंटीरियर (चित्रा 2) पर लगे ईएसपी 32 नियंत्रण बोर्ड के बंदरगाहों पर सभी घटकों (पावर बटन, पोटेंशियोमीटर, समय / स्टार्ट टचपैड, एलईडी, ब्राइटनेस सेंसर, एलसीडी, बजर और बिजली की आपूर्ति) स्थापित करें।
  9. प्रोग्रामिंग कोड अपलोड करें (पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, और पूरक फ़ाइल 5) और यह जांचने के लिए एक परीक्षण चलाएं कि सभी कनेक्शन काम कर रहे हैं (चित्रा 1 एच)।
  10. बक्से को इकट्ठा करें और अंतराल से बचने के लिए उन्हें एक साथ ठीक करें, और परिणामस्वरूप बाहरी प्रकाश हस्तक्षेप और उत्सर्जित प्रकाश हानि। प्रोटोटाइप के शीर्ष पर ड्रिल किए गए क्षेत्र में माउंटेड कंट्रोल यूनिट संलग्न करें (चित्रा 1 आई)।
  11. दो छोटे हिंज के साथ बड़े बॉक्स पर एक ही सामग्री और 330 मिमी x 225 मिमी (लंबाई x चौड़ाई) आयामों का एक सामने का दरवाजा तय करें। इसके अलावा, प्रोटोटाइप बंद करने को मजबूत करने के लिए वेल्क्रो टेप को बड़े बॉक्स में साइडवे संलग्न करें (चित्रा 1 जे)। उपकरण के सामने के दरवाजे में हेरफेर करने के लिए एक हैंडल स्थापित करें।
  12. संचालन के दौरान अधिक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोटाइप के निचले भाग में चार रबर फुट पैड संलग्न करें (चित्रा 1 के)।

2. सेल लाइनें: खेती, बीजारोपण और उपचार

  1. रसायन
    1. 100 एमएम की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पोर्फिरीन को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग करें।
      चेतावनी: डीएमएसओ को सावधानीपूर्वक हेरफेर किया जाना चाहिए (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के उपयोग के साथ और हवादार क्षेत्र में संभालना)। अत्यधिक प्रकाश जोखिम से बचने के लिए स्टॉक और पतला समाधान दोनों को सावधानीपूर्वक हेरफेर करें।
  2. सेल लाइनें
    1. डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) कम ग्लूकोज माध्यम में हेला सेल लाइन की खेती 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% जेंटामाइसिन के साथ पूरक है।
    2. कल्चर फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    3. कोशिकाओं को तब तक प्रबंधित और निरीक्षण करें जब तक कि वे 80% -90% संगम तक नहीं पहुंच जाते।
  3. बीज बोने की प्रक्रिया
    1. फ्लास्क से संस्कृति माध्यम को हटा दें।
    2. सेल मोनोलेयर को पीबीएस के साथ धोएं।
    3. ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.5%) के साथ कॉन्फ्लुएंट सेल कल्चर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अलग करें। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% जेंटामाइसिन के साथ पूरक संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करके ट्रिप्सिन की कार्रवाई को रोकें।
    4. हेमोसाइटोमीटर के साथ पुन: निलंबित कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें 2.0 × 104 कोशिकाओं / कुएं पर 96-वेल प्लेट में बीज दें।
    5. अंधेरे और प्रकाश की स्थिति के लिए दो प्लेटें तैयार करें।
    6. सेल अटैचमेंट के लिए प्लेटों को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. उपचार प्रक्रिया
    1. दोनों 96-वेल प्लेटों से माध्यम को हटा दें।
    2. कोशिकाओं को वर्टेपोरफिन की बढ़ती सांद्रता के 100 μL के साथ उपचार करें (0.045 से 24 μM, सीरियल कमजोर पड़ने)।
    3. वर्टेपोरफिन आंतरिककरण की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए दवा उपचार के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. 24 घंटे के बाद, दवा युक्त माध्यम को छोड़ दें, पीबीएस (100 μL) के साथ कोशिकाओं के मोनोलेयर को धोएं, और दवा मुक्त माध्यम (100 μL) जोड़ें।
    5. इसे प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक माइक्रोप्लेट को कवर करें और इसे 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। यह प्लेट पीडीटी परिणामों (अंधेरे स्थिति) के लिए नियंत्रण डेटा प्रदान करेगी। अन्य माइक्रोप्लेट का उपयोग डिवाइस में प्रकाश जोखिम की स्थिति पर किया जाएगा।

3. डिवाइस ऑपरेशन

  1. पीडीटी डिवाइस को विद्युत आउटलेट में प्लग करें और पावर बटन दबाकर इसे चालू करें।
  2. पीडीटी डिवाइस में अन्य माइक्रोप्लेट (प्रकाश स्थिति) रखें और वेल्क्रो टेप के साथ सामने के दरवाजे को बांधकर उपकरण बंद करें।
  3. आरजीबी कॉन्फ़िगरेशन (यहां आरजीबी 255, 255, 255 प्रयोग) को समायोजित करने के लिए पोटेंशियोमीटर का उपयोग करें और प्रकाश उत्सर्जन का रंग सेट करें।
    नोट: प्रत्येक आरजीबी संयोजन में एक विशिष्ट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है, जिसे विभिन्न फोटोसेंसिटाइज़र के साथ प्रयोगों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए और परिणामस्वरूप, अलग-अलग अवशोषण वक्र।
  4. समय कॉन्फ़िगरेशन (यहां 60 मिनट का प्रयोग) को समायोजित करने के लिए (+)/(-) टचपैड दबाएं और परख की अवधि निर्धारित करें।
    नोट: विकिरण मूल्य के साथ मिलकर समय विन्यास, प्रक्रिया की समृद्धि निर्धारित करेगा- परख में लागू प्रकाश खुराक।
  5. डिस्प्ले पर सेटअप जानकारी की जाँच करें।
  6. परख शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं। सुनिश्चित करें कि परख की शुरुआत में एक-बीप बजर सुना जाता है।
  7. प्रयोग के दौरान, डिस्प्ले पर वास्तविक समय की जानकारी का निरीक्षण करें , जैसे विकिरण और शेष समय।
  8. पीडीटी परख के दौरान सामने का दरवाजा न खोलें या कोई कॉन्फ़िगरेशन न बदलें।
  9. परख के अंत में, चार-बीप बजर की प्रतीक्षा करें और इलेक्ट्रॉनिक सिस्टम के लिए सभी एलईडी को बंद कर दें। प्रदर्शन में प्रयोग के दौरान एक तैयार संदेश और व्यय की गई ऊर्जा की अंतिम मात्रा का निरीक्षण करें।
    नोट: फ्लुएंस अंतिम मूल्य की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके की जाती है:
    Equation 1 (1)
    जहां F, J/cm2 के बराबर है और I mW/cm2 या mJ/s.cm2 के बराबर है। विकिरण मान एलईडी (उत्सर्जक स्रोत) की शक्ति और अंधेरे कक्ष (660 सेमी2) के समान रूप से विकिरणित क्षेत्र पर विचार करता है (समीकरण [2]):
    Equation 2 (2)
    पूरे पीडीटी परख में डिवाइस डिस्प्ले पर सैद्धांतिक विकिरण मूल्य दिखाया गया है। ऑपरेशन के अंत में, समृद्धि की गणना करने के लिए समीकरण (3) का उपयोग करें:
    फ्लुएंस (एफ) = विकिरण (I, स्थिर मान) × ऑपरेशन समय (s) (3)

4. सेल व्यवहार्यता परख

  1. पीडीटी परख के बाद, प्रकाश के संपर्क में आने वाली माइक्रोप्लेट को कवर करें और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, दोनों प्लेटों से संस्कृति माध्यम को हटा दें, पीबीएस (100 μL) के साथ कोशिकाओं के मोनोलेयर को धोएं, और MTT समाधान (0.5 मिलीग्राम / ml, 100 μL) जोड़ें। फॉर्माज़ान क्रिस्टल गठन की अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए दोनों प्लेटों-अंधेरे और हल्के परिस्थितियों को इनक्यूबेट करें।
  3. एमटीटी समाधान को सावधानी से हटा दें और बैंगनी क्रिस्टल को डीएमएसओ / इथेनॉल (1: 1) समाधान के साथ भंग करें।
  4. क्रिस्टल के पूर्ण विघटन के बाद, 595 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण माप करें।
    नोट: डिवाइस का उपयोग अन्य महत्वपूर्ण प्रयोगों में किया जा सकता है जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री30 द्वारा प्रकाश जोखिम के बाद फोटोसेंसिटाइज़र द्वारा ट्रिगर आरओएस-मध्यस्थता कोशिका मृत्यु।

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Representative Results

फोटोएक्ट नामक अंतिम पीडीटी डिवाइस में चार मल्टीवेल माइक्रोप्लेट आवंटित करने के लिए एक अंधेरा कक्ष शामिल था, जिसकी ऊपरी आंतरिक सतह दृश्य प्रकाश के अलग-अलग स्पेक्ट्रम का उत्सर्जन करने के लिए प्रोग्राम किए गए 30 बिखरे हुए एलईडी के एक सेट से लैस थी (चित्रा 3 और पूरक फ़ाइल 6)। डिवाइस को दो संबद्ध बक्से का उपयोग करके बनाया गया था: पीडीटी परख के लिए एक अंधेरे कक्ष के रूप में डिज़ाइन किया गया एक आंतरिक बॉक्स, और आंतरिक कक्ष को कवर करने और नियंत्रण इकाई को पकड़ने के लिए एक बाहरी बॉक्स (चित्रा 1 बी)। आंतरिक बॉक्स को काले रंग से चित्रित किया गया था (चित्रा 1 डी) और 30 एलईडी और 1 मीटर लंबाई (जिसे बाद में तीन टुकड़ों में काट दिया गया था) और 9 वाट के साथ एलईडी आरजीबी डब्ल्यूएस 2812 (या डब्ल्यूएस 281 बी) के टेप मॉडल से बना था, जिसमें एक अंतर्निहित प्रोसेसर है। इस उपकरण ने अधिक नियंत्रित उपयोग और परिणामस्वरूप, अधिक सटीक रंग उत्सर्जन की अनुमति दी। 30 एलईडी को पीडीटी कक्ष की पूरी ऊपरी आंतरिक सतह पर 10 एलईडी के साथ तीन समानांतर टेप द्वारा समान रूप से वितरित किया गया था (चित्रा 1 ई)। काले आंतरिक सतहों की कम परावर्तकता और एलईडी कॉन्फ़िगरेशन के समान वितरण के कारण एक सजातीय प्रकाश घटना स्थापित की गई थी। प्रकाश की घटनाओं को इंगित करने और गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण के रूप में काम करने के लिए आंतरिक बॉक्स के निचले केंद्र में एक टीएसएल 2561 ब्राइटनेस सेंसर भी शामिल किया गया था, जो अंधेरे कक्ष (पूरक तालिका एस 1) के अंदर विकिरण एकरूपता की गारंटी देता है और एलईडी सिस्टम की शक्ति की निगरानी करता है, जिसे उपयोगी जीवन के घंटों की एक निश्चित संख्या के लिए जाना जाता है (चित्रा 1 एफ) ). बाहरी बॉक्स एक संरचना है जो आंतरिक बॉक्स को कवर करती है, जो छह एमडीएफ भागों से बनी होती है, ग्रे रंग से पेंट की जाती है, और एक आदर्श फिट के लिए लेजर-कट (आंकड़े 1 ए, बी)। नियंत्रण इकाई को ऑनलाइन सॉफ्टवेयर31, 3 डी का उपयोग करके डिजाइन किया गया था, जो 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके एकल भाग के रूप में पॉलीलैक्टिक एसिड के साथ मुद्रित था, और ग्रे रंग में चित्रित किया गया था। इसमें सभी इलेक्ट्रॉनिक्स घटक हैं, जिनमें एक डिस्प्ले, पोटेंशियोमीटर, बटन और एक बजर (चित्रा 1 आई और चित्रा 2) शामिल हैं।

स्वतंत्र प्रकाश घटना समायोजन को सक्षम करने के लिए, ईएसपी 32 नियंत्रक बोर्ड को नियंत्रण इकाई (चित्रा 2) को एकीकृत करने के लिए चुना गया था। यह कॉन्फ़िगरेशन प्रोग्रामिंग, ब्लूटूथ, वाई-फाई, दोहरे कोर प्रोसेसर, कई पोर्ट, और एक अंतर-एकीकृत सर्किट (आई 2 सी), एक सीरियल परिधीय इंटरफ़ेस (एसपीआई), और अन्य इंटरफेस के साथ संवाद करने की क्षमता के लिए एक यूएसबी इंटरफ़ेस की अनुमति देनी चाहिए। सिस्टम को संचालित करने के लिए, एक एकीकृत विकास वातावरण (आईडीई) के माध्यम से सी भाषा में एक कार्यक्रम लिखा गया था। कोड संरचना32 FreeRTOS पर आधारित है, जो ESP32 नियंत्रक बोर्ड द्वारा समर्थित एक मुफ्त, वास्तविक समय परिचालन प्रणाली है। संदर्भित तर्क स्वतंत्र अनुप्रयोग प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है, जिसे ईएसपी 32 द्वारा सोपान या समानांतर दृष्टिकोण में संसाधित किया जा सकता है, जिससे परियोजना और इसके रखरखाव, सुधार और अद्यतन प्रक्रियाएं अधिक बहुमुखी और सुरक्षित हो जाती हैं।

मशीन और ऑपरेटर के बीच इंटरफ़ेस उपयोगकर्ता के अनुकूल है और इसमें एक तरल क्रिस्टल डिस्प्ले (एलसीडी), पोटेंशियोमीटर, बटन और एक बजर (चित्रा 3 और पूरक फ़ाइल 6) शामिल हैं। छोटे, 16 मिमी x 2 मिमी (कॉलम बनाम लाइनें) एलसीडी में आई 2 सी संचार प्रोटोकॉल के साथ एक अंतर्निहित एचडी 44780 नियंत्रक था, जो क्रमशः स्थापना और संचरण बहुमुखी प्रतिभा की आसानी प्रदान करता है। प्रारंभिक सेटअप में आरजीबी और ऑपरेटर द्वारा समय समायोजन शामिल हैं। प्रकाश परिमाण और रंग विन्यास को पोटेंशियोमीटर का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है, जो तीन मूल रंग घटकों-आरजीबी की तीव्रता (0 से 255) को संशोधित करता है। इन समायोजनों के परिणामस्वरूप अंतरराष्ट्रीय आरजीबी रंग तालिका33 में संबोधित कई रंग रचनाएं हो सकती हैं। प्रत्येक आरजीबी संरचना एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का मालिक है, जिसे पीडीटी प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले पीएस के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए; फोटोएक्टिवेशन को संतोषजनक ढंग से होने के लिए पीएस के अवशोषण वक्र और विकिरण की तरंग दैर्ध्य को अतिव्यापी किया जाना चाहिए (पूरक चित्रा एस 1)। प्रक्रिया के साथ, शेष समय के साथ ऑपरेशन की स्थिति और प्रकाश घटना की जानकारी एलसीडी पर एक्सेस की जा सकती है।

प्रोग्राम किए गए समय के अंत में, इलेक्ट्रॉनिक्स सिस्टम ने सभी एलईडी को बंद कर दिया, एक श्रव्य चेतावनी उत्सर्जित की, और प्रदर्शन पर प्रति क्षेत्र ऊर्जा की कुल मात्रा (जे / सेमी²) दिखाई, जिसकी गणना सेकंड में ऑपरेशन समय द्वारा विकिरण के निरंतर मूल्य को गुणा करके की गई थी। इस डिजिटल मॉडल ने पहचान स्तरों (0.1 और 40,000+ लक्स के बीच की सीमा), एक आई 2 सी इंटरफ़ेस, और विद्युत प्रवाह की कम तीव्रता (क्रमशः ऑपरेशन और स्टैंडबाय स्थिति में 0.5 एमए और 15 μA) की एक विस्तृत श्रृंखला प्रस्तुत की।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, डिवाइस का उपयोग 1 घंटे (49.1 ± 0.6 जे / सेमी 2) के प्रकाश जोखिम के बाद 2 डी हेला सेल संस्कृति में वर्टेपोरफिन के साइटोटोक्सिक प्रभाव को बढ़ाने के लिए कियागया था। जैसा कि चित्र 4 ए में दिखाया गया है, जीआई50 मान प्रकाश की स्थिति के लिए 3.1 μM और अंधेरे की स्थिति के लिए 13.8 μM था। इस प्रकार, शर्तों की तुलना करने वाले 4.4 गुना बदलाव ने पीएस के रूप में वर्टेपोरफिन के उपयोग और पीडीटी परख के लिए फोटोएसीटी की प्रयोज्यता को मान्य किया। इस काम में वर्णित प्रोटोटाइप के उपयोग को मान्य करने के लिए, एक वाणिज्यिक पीडीटी डिवाइस का उपयोग उसी प्रयोगात्मक परिस्थितियों में किया गया था, जिसमें पीएस, कोशिकाएं और समृद्धि शामिल थी, और परिणामों की तुलना की गई थी। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, दोनों डिवाइस समान रूप से फोटोएक्टिवेटेड वर्टेपोरफिन, साइटोटोक्सिक प्रभाव को बढ़ाते हैं। इन परिणामों ने घर-निर्मित पीडीटी डिवाइस (चित्रा 4 ए, बी) में इसकी प्रयोज्यता की पुष्टि की। अंत में, प्रकाश जोखिम के बाद वर्टेपोरफिन द्वारा ट्रिगर आरओएस-मध्यस्थता कोशिका मृत्यु की पुष्टि डीसीएफडीए परख (चित्रा 4 सी, डी) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा की गई थी।

Figure 1
चित्र 1: फोटोएसीटी निर्माण और विधानसभा निर्देश। डिवाइस में घटकों के निर्माण, ड्रिलिंग, पेंटिंग, माउंटिंग और एक्सेसिंग का विस्तृत चित्रण। पैनल डिवाइस बनाने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका दिखाता है। संक्षिप्त नाम: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: नियंत्रण इकाई निर्माण और इलेक्ट्रॉनिक स्थापना निर्देश। प्रोटोटाइप में उपयोग किए जाने वाले कनेक्शन और घटकों के साथ ईएसपी 32 कंट्रोलर बोर्ड पोर्ट पर विस्फोटित नियंत्रण इकाई और इलेक्ट्रॉनिक कनेक्शन की विस्तृत योजना को ज़ूम-इन व्यू ड्राइंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: फोटोएसीटी प्रतिनिधित्व। सामग्री के बिल, लेबलिंग गुब्बारे और ऊपरी इंटीरियर एलईडी के विस्तृत दृश्य के साथ अंतिम उत्पाद डिजाइन का असेंबली ड्राइंग। आंकड़ा प्रोटोटाइप के भागों और घटकों की पहचान करने की अनुमति देता है। संक्षेप: एमडीएफ = मध्यम घनत्व फाइबरबोर्ड; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए, बी) एमटीटी विधि का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन किया गया: विभिन्न सांद्रता में फोटोसेंसिटाइज़र वर्टेपोरफिन के साइटोटोक्सिक प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण आयोजित किए गए थे। हेला कोशिकाओं को वर्टेपोरफिन (0.045-24 μM) की विभिन्न सांद्रता के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था, प्रकाश (फोटोएसीटी (ए) या वाणिज्यिक पीडीटी उपकरण (बी)) या अंधेरे स्थितियों के संपर्क में लाया गया था, और फिर एमटीटी परख के अधीन किया गया था। दोनों स्थितियों ने वर्टेपोरफिन की उच्च सांद्रता में सेल व्यवहार्यता में कमी दिखाई, लेकिन पीडीटी से प्राप्त प्रकाश जोखिम ने पीएस के साइटोटोक्सिक प्रोफाइल को बढ़ाया, जिसका अर्थ है कि पीडीटी वर्टेपोरफिन की साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाता है। व्यवहार्यता वक्रों को ग्राफपैड प्रिज्म 6 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फिट किया गया था। (C, D) हेला कोशिकाओं को वर्टेपोरफिन (0.187 μM और 6 μM) की कम और उच्च सांद्रता के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया गया था और फिर प्रकाश (फोटोएसीटी) या अंधेरे स्थितियों के संपर्क में लाया गया था। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर को डीसीएफडीए जांच (1 μM पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेशन) का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विकिरण के बाद मापा गया था। हिस्टोग्राम के बीच एक सही बदलाव ने डीसीएफ के उच्च इंट्रासेल्युलर संचय के कारण उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता को निहित किया, और इस प्रकार, अधिक आरओएस स्तर। परिणामों ने अंधेरे स्थिति (सी) में आरओएस के स्तर में कोई प्रासंगिक अंतर नहीं दिखाया, लेकिन वर्टेपोरफिन फोटोएक्टिवेशन (डी) के बाद आरओएस के स्तर में खुराक-प्रतिक्रिया वृद्धि दिखाई। संक्षेप: आरओएस = प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां; डीसीएफ = 2', 7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन; डीसीएफडीए = 2',7'-डाइक्लोरोहीड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: डिवाइस का निर्णय फ़्लोचार्ट: प्रारंभिक सेटअप और ऑपरेशन समस्या निवारण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: वर्टेपोरफिन के अवशोषण वक्र और डिवाइस के एलईडी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के बीच ओवरलैप। फोटोसेंसिटाइज़र (x, y') को फोटोएक्टिवेट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले RGB 255, 255, 255-सफेद रंग (3,700K-5,000K CCT) के एलईडी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ वर्टेपोरफिन का अवशोषण स्पेक्ट्रम। वर्टेपोरफिन और सफेद विकिरण प्रकाश के विभिन्न अवशोषण चोटियों के बीच ओवरलैप फोटोसेंसिटाइज़र के फोटोएक्टिवेशन की पुष्टि करता है, जिसकी पुष्टि जैविक परिणामों द्वारा भी की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: विकिरण एकरूपता परीक्षण। विकिरणित क्षेत्र के विभिन्न बिंदुओं पर चमक सेंसर द्वारा मापा गया तत्काल चमक (लुमेन)। प्रस्तुत परिणाम कोई अभिव्यंजक भिन्नता नहीं दिखाते हैं, जो डिवाइस के समान विकिरण को प्रमाणित करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: काटने के लिए वेक्टर फ़ाइल। एमडीएफ बोर्ड काटने के लिए ड्राइंग (डीडब्ल्यूजी) फाइल। फ़ाइल का उपयोग कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (CNC) काटने के लिए किया जाना चाहिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: इकाई नियंत्रण की 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइल। डिवाइस की नियंत्रण इकाई को 3 डी प्रिंट करने के लिए स्टीरियोलिथोग्राफी (एसटीएल) फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: सी प्रोग्रामिंग कोड। उपकरण की नियंत्रण इकाई को कॉन्फ़िगर करने के लिए सी भाषा में प्रोग्रामिंग कोड विकसित किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: INO प्रोग्रामिंग कोड। उपकरण की नियंत्रण इकाई को कॉन्फ़िगर करने के लिए INO भाषा में प्रोग्रामिंग कोड विकसित किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: संकलन निर्देश। मार्कडाउन (एमडी) प्रोग्रामिंग कोड संकलन के लिए अतिरिक्त निर्देशों के साथ "रीड मी" फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: डिवाइस का डिजाइन मॉडल। प्रोटोटाइप के सामान्य विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उत्पाद डेटा के आदान-प्रदान के लिए मानक का पूर्वावलोकन (STEP) त्रिआयामी मॉडल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अंतिम फोटोएसीटी डिवाइस $ 50 से कम की कुल लागत पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, कम लागत वाले घटकों के साथ निर्माण करने के लिए सुविधाजनक था। अतिरिक्त लाभों में कम रखरखाव की मांग, कई प्रकार की संस्कृति प्लेटों को विकिरणित करने की क्षमता, प्रति परख चार इकाइयों तक का एक साथ उपयोग, कम वजन (2 किलोग्राम)/आकार (44 सेमी3) शामिल हैं जो पोर्टेबिलिटी, सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण (डेटा नहीं दिखाया गया है) की अनुमति देता है, और एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सरल सेटअप इंटरफ़ेस जिसे कंप्यूटर या अन्य मशीनों से कनेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है।

निर्माण और संचालन प्रोटोकॉल दोनों के कुछ महत्वपूर्ण कदमों ने परियोजना अवधारणा के दौरान सुधार के अवसरों को जन्म दिया। चूंकि पीडीटी कक्ष को सजातीय प्रकाश उत्सर्जन और सुसंगत ऊर्जा माप की आवश्यकता होती है, इसलिए बाहरी प्रकाश हस्तक्षेप और उत्सर्जित प्रकाश हानि दोनों से बचने के लिए आंतरिक और बाहरी बक्से को सील कर दिया गया था। कक्ष बंद करने और निर्बाध प्रयोगों को सुनिश्चित करने के लिए फ्रंटल दरवाजे पर अतिरिक्त वेल्क्रो टेप तय किए गए थे। आवश्यक आरजीबी कॉन्फ़िगरेशन को प्रमाणित करने के लिए नियंत्रण इकाई में एक प्रतिनिधि एलईडी स्थापित किया गया था, जो परख के दौरान उत्सर्जित प्रकाश के रंग और तीव्रता को दर्शाता है। अंत में, प्रोग्रामिंग कोड ने तत्काल घनत्व माप और ऊर्जा मूल्यांकन की अंतिम मात्रा को परिष्कृत करने के लिए कई उन्नयन किए, प्रजनन क्षमता और गणितीय स्थिरता का समर्थन किया। कुछ अन्य प्रमुख विवरण जिन पर अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता है उनमें शामिल हैं: (i) प्रतिनिधि और संतुलित परिणाम प्राप्त करने के लिए एलईडी का सजातीय वितरण और चमक सेंसर की केंद्रीय स्थिति, (ii) इलेक्ट्रॉनिक आरेख (चित्रा 2) और प्रोग्रामिंग कोड (पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, और पूरक फ़ाइल 5) के अनुसार सभी घटकों की स्थापना। ) सही संचालन सुनिश्चित करने के लिए, और (iii) विश्वसनीय परिणामों के साथ लगातार प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए एक प्रयोग चलाने से पहले सेटअप (एक ही आरजीबी और समय कॉन्फ़िगरेशन रखना)। यद्यपि आरजीबी प्रणाली विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ कई दृश्यमान रंग रचनाएं प्रदान करती है, गैर-दृश्यमान प्रकाश प्रयोगों को विशिष्ट प्रोटोकॉल उन्नयन की आवश्यकता होगी। ऑपरेशन के दौरान समस्याओं या त्रुटियों को खोजने और सही करने के लिए एक व्यवस्थित समस्या-समाधान दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए चित्रा 5 में एक निर्णय फ़्लोचार्ट प्रस्तुत किया गया है।

2 डी हेला कोशिकाओं (चित्रा 4) में साइटोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए वर्टेपोरफिन के चिकित्सीय सक्रियण के साथ प्राप्त मान्य परिणामों के साथ इन विट्रो प्रयोग की मांगों को पूरा करने के लिए डिज़ाइन किया गया, फोटोएसीटी को विश्वविद्यालयों, स्कूलों, उद्योगों और अन्य अनुसंधान केंद्रों के लिए अनुशंसित किया जा सकता है। इस उपकरण को फोटोसेंसिटाइज़र और उनके नैदानिक अनुप्रयोगों की कार्रवाई के तंत्र की खोज करने वाले वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए पीडीटी के लाभों का विस्तार करना चाहिए।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम आर्थर हेनरिक गोम्स डी ओलिवेरा और लुकास जूलियन क्रूज़ गोम्स को फिल्मांकन प्रक्रिया में मदद करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना को ब्राजील के अनुसंधान परिषद (सीएनपीक्यू, अनुदान संख्या 400953/2016-1-404286/2021-6) और फंडाको अरौकारिया-पीपीएसयूएस 2020/2021 (एसयूएस 2020131000003) द्वारा समर्थित किया गया था। इस अध्ययन को कूर्डेनाको डी एपर्फीकोआमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर-ब्रासिल (सीएपीएस)-वित्त कोड 001 द्वारा भी वित्तपोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054 Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer Flashforge Finder model
96-well plates Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board ESP32
Design Software Trimble SketchUp
DMEM High Glucose Gibco 11965092 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO Sigma-Aldrich D4540-500ML Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum  Gibco 12657029 FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750060 Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED
Laminar Flow Hood Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards 3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader ThermoFischer Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent Invitrogen M6494 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System Real Time Engineers ltd. FreeRTOS
P10 micripipette Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment LumaCare Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Gibco 10010031 Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin Sigma-Aldrich SML0534-5MG Verteporfin, ≥94% (HPLC)

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References

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जैव रसायन अंक 191
2 डी सेल कल्चर मॉडल में वर्टेपोरफिन साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए एक इन-हाउस-बिल्ट और लाइट-एमिटिंग-डायोड-आधारित फोटोडायनामिक थेरेपी डिवाइस
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Zanzarini, I. d. S., Barbosa, G., Prado, L. d. O., Zattoni, I. F., Da Paz, G., Prado, A. L. d., Volanski, W., Lavarda, M. D., Rego, F. G. d. M., Picheth, G., Moure, V. R., Valdameri, G. An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model. J. Vis. Exp. (191), e64391, doi:10.3791/64391 (2023).

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