Artigo de método

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

DOI:

10.3791/64404

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23 de dezembro de 2022

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1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

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Resumo

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A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Resumo

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A aquicultura é um dos setores produtores de alimentos que mais crescem em todo o mundo e o cultivo de tilápia (Oreochromis spp.) constitui a principal variedade de peixes de água doce cultivada. Como as práticas de aquicultura são suscetíveis à contaminação microbiana derivada de fontes antropogênicas, é necessário o uso extensivo de antibióticos, levando os sistemas de aquicultura a se tornarem uma importante fonte de bactérias patogênicas e resistentes a antibióticos de relevância clínica, como a Escherichia coli (E. coli). Aqui, as características de resistência antimicrobiana, virulência e mobiloma de uma cepa patogênica de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada no interior, foram elucidadas por meio de sequenciamento de genoma completo (WGS) e análise in silico . Foram realizados testes de suscetibilidade a antimicrobianos (AST) e WGS. Além disso, o grupo filogenético, o sorotipo, a tipagem de sequência multilocus (MLST), a resistência antimicrobiana adquirida, a virulência, o plasmídeo e o conteúdo de prófagos foram determinados usando diversas ferramentas web disponíveis. O isolado de E. coli apresentou apenas suscetibilidade intermediária à ampicilina e foi caracterizado como cepa ONT:H21-B1-ST40 por tipagem baseada em WGS. Embora apenas um único gene relacionado à resistência antimicrobiana tenha sido detectado [mdf(A)], vários genes associados à virulência (VAGs) do patótipo enteropatogênico atípico de E. coli (aEPEC) foram identificados. Além disso, a carga de replicões plasmídicos de grandes grupos plasmídicos e 18 regiões associadas a prófagos foram detectadas. Em conclusão, a caracterização do WGS de um isolado de aEPEC, recuperado de uma piscicultura em Sinaloa, México, permite insights sobre seu potencial patogênico e o possível risco para a saúde humana do consumo de produtos aquícolas crus. É necessário explorar técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) para estudar microrganismos ambientais e adotar uma estrutura de saúde única para aprender como os problemas de saúde se originam.

Introdução

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A aquicultura é um dos setores produtores de alimentos que mais crescem em todo o mundo, e suas práticas de produção destinam-se a satisfazer a crescente demanda de alimentos para consumo humano. A produção aquícola global triplicou de 34 milhões de toneladas (Mt) em 1997 para 112 Mt em 20171. Os principais grupos de espécies, contribuindo para quase 75% da produção, foram algas marinhas, carpas, bivalves, bagres e tilápias (Oreochromis spp.) 1. No entanto, o aparecimento de doenças causadas por entidades microbianas é inevitável devido à piscicultura intensiva, levando a potenciais perdas econômicas

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Protocolo

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NOTA: A cepa ACM5 de E. coli foi recuperada por meio do processamento e cultivo da amostra de peixes para determinação de coliformes fecais (CF)12. Durante a amostragem dos peixes, os peixes não apresentaram sinais clínicos de doença, infecção bacteriana ou fúngica, prevalecendo uma temperatura média de 22,3 °C. Após o isolamento, o isolado de E. coli foi submetido a testes bioquímicos e criopreservado em caldo de infusão cardíaca cerebral (BHI) com DMSO (8% v/v) como agente crioprotetor.

1. Reativação da cultura de estoque de E. coli ACM5 congelada

  1. A partir do es....

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Resultados

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A suscetibilidade aos antimicrobianos foi determinada pelo método de difusão em disco e interpretada pelos critérios de ponto de interrupção do CLSI para 12 antibióticos abrangendo seis classes antimicrobianas distintas, ou seja, aminoglicosídeos, β-lactâmicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, fenicol e antagonistas da via do folato. A E. coli ACM5 apresentou sensibilidade a todos os antibióticos, exceto a um fármaco β-lactâmico. Quatro drogas β-lactâmicas foram testadas: ampicilina, carbenicilina, cefalotina e c.......

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Discussão

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Este estudo apresenta uma adaptação do fluxo de trabalho do WGS bacteriano utilizando um sequenciador de bancada e um pipeline para caracterização genômica de uma variante patogênica de E. coli. Dependendo da plataforma de sequenciamento utilizada, os tempos de resposta (TATs) para procedimentos laboratoriais úmidos (cultivo bacteriano, extração de gDNA, preparação de biblioteca e sequenciamento) e análise de sequência podem variar, particularmente se bactérias de crescimento lento forem estudadas. Seguindo o pr.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia do México (CONACyT) pela bolsa de doutorado concedida a José Antonio Magaña-Lizárraga [No. 481143].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Accublock Mini banho seco digitalLabnetD0100Banho seco para incubação de tubos
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Grânulos magnéticos em solução para purificação de biblioteca de DNA
DeNovix DS-11DeNovix Inc.Espectrofotômetro UV-Vis para verificar a qualidade do DNA extraído com gDNA
Tubos LoBindEppendorf0030108418Tubos de PCR de 1,5 mL para agrupamento de bibliotecas de DNA
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DRack de microtubos magnéticos usado durante a purificação de DNA baseada em esferas magnéticas
Gram-negative Multibac I.D.Pesquisa de diagnóstico (México)PT-35Discos antibióticos padrão comercial para testes de suscetibilidade antimicrobiana
Kit de saída intermediária MiniSeq (300 ciclos)IlluminaFC-420-1004Cartucho de reagentes para sequenciamento de extremidade emparelhada (2x150)
Instrumento do sistema MiniSeqIlluminaSY-420-1001Sequenciador de bancada usado para
centrífugaMiniSpin de sequenciamento de próxima geraçãoEppendorf5452000816Centrífuga padrão para tubos
Kit de preparação da biblioteca de DNA Nextera XTReagentes IlluminaFC-131-1024para realizar bibliotecas de DNA para sequenciamento. Inclui reagentes Caixa 1 e Caixa 2 para 24 amostras
Kit de Índice Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Conjunto de Índice A, B, C, D
Controle PhiX v3IlluminaFC-110-3001Controle de biblioteca de DNA para sequenciamento
Banho-maria de precisãoLabCare America51221081Agitador de banho-maria usado para cultura bacteriana
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reagentes para ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência
Fluorômetro Qubit 2.0Invitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorômetro usado para ensaio de fluorescência 
Tubos de ensaio de qubitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856Tubos de PCR de 0,5 mL para ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência 
SimpliAmp TermocicladorApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Termociclador usado para amplificação de biblioteca de DNA
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Espectrofotômetro usado para suspensão bacteriana em testes de suscetibilidade antimicrobiana
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.Kit D4300para extração de DNA genômico (50 preparações)

Referências

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  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....

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Reimpressões e permissões

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

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