Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Summary

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Abstract

A doença de Parkinson é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais comum e é caracterizada pela morte celular progressiva causada pela formação de corpos de Lewy contendo α-sinucleína mal dobrada e agregada. α-sinucleína é uma proteína pré-sináptica abundante que regula o tráfico de vesículas sinápticas, mas o acúmulo de suas inclusões proteicas resulta em neurotoxicidade. Estudos recentes revelaram que vários fatores genéticos, incluindo chaperonas bacterianas, poderiam reduzir a formação de agregados de α-sinucleína in vitro. No entanto, também é importante monitorar o efeito anti-agregação na célula para aplicá-lo como um tratamento potencial para os pacientes. Seria ideal usar células neuronais, mas essas células são difíceis de manusear e levam muito tempo para exibir o fenótipo anti-agregação. Portanto, uma ferramenta in vivo rápida e eficaz é necessária para a avaliação adicional da atividade antiagregação in vivo. O método aqui descrito foi utilizado para monitorar e analisar o fenótipo antiagregação na levedura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expressou α-sinucleína humana. Este protocolo demonstra ferramentas in vivo que poderiam ser usadas para monitorar a toxicidade celular induzida por α-sinucleína, bem como a formação de agregados de α-sinucleína nas células.

Introduction

A doença de Parkinson (DP) é um problema sério para as sociedades em envelhecimento em todo o mundo. A agregação de α-sinucleína está intimamente associada à DP, e agregados proteicos de α-sinucleína são amplamente utilizados como biomarcador molecular para o diagnóstico da doença¹. α-sinucleína é uma pequena proteína ácida (140 aminoácidos de comprimento) com três domínios, a saber, a α-hélice de ligação lipídica N-terminal, o domínio central de ligação a amiloide (NAC) e a cauda ácida C-terminal². O desdobramento da α-sinucleína pode ocorrer espontaneamente e, eventualmente, leva à formação de agr....

Protocol

1. Preparação de meios e soluções

1. Preparação para a mídia
   1. Para preparar o meio YPD, dissolver 50 g de pó de YPD em dH₂O para fazer um volume final de 1 L. Autoclave para esterilização. Armazenar à temperatura ambiente (RT).
   2. Para fazer meio de ágar YPD, dissolver 50 g de pó de YPD e 20 g de ágar em 1 L de dH₂O. Autoclave para esterilização. Depois de esfriar, despeje em placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   3. Para fazer SC com meio de rafinose (SRd)-Ura, dissolver 6,7 g de levedura à base de nitrogênio com sulfato de amônio e sem aminoácidos em 795 mL de dH₂O. Autoclave para esterilizaç....

Results

A alta expressão de α-sinucleína é conhecida por estar ligada à morte celular neuronal e à DP em sistemas modelo de DP. Este estudo descreve três métodos para monitorar a citotoxicidade da α-sinucleína e a formação de focos de α-sinucleína agregada em leveduras. Aqui, a α-sinucleína foi superexpressa em levedura, e os fenótipos de sinucleína α selvagem e três variantes de α-sinucleína conhecidas como mutantes familiares da DP foram examinados (Figura 1 e Tabela de Materiais).......

Discussion

Dada a complexidade de vários sistemas celulares em humanos, é vantajoso usar levedura como modelo para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Embora seja quase impossível investigar as complexas interações celulares do cérebro humano usando leveduras, a partir de uma perspectiva unicelular, as células de levedura têm um alto nível de semelhança com as células humanas em termos de homologia da sequência genômica e processos celulares eucarióticos fundamentais ^8,13.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 96 poços	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Membrana de vedação permeável a gás para placas de microtitulação
cobre vidros	Marienfeld		24 x 60 mm
Tubo de cultura	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glicose	sigma	G8270
D-(+)-Rafinose pentahidratada	Daejung	6638-4105
Incubadora (agitação)	Modelo Labtron		: SHI1
Incubadora (estática)	Visão científica		modelo: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Leitor de microplacas	Tecan	30050303 01	Modelo: Pipeta multicanal Infinite 200 pro
20-200 µ Pipeta	gilson	FA10011
2-20 µ L	gilson	FA10009
microscópio Olympus	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	peso médio de mol 3.350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Vetores de transporte multifuncionais de levedura de alto número de cópias. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. As células de levedura fornecem informações sobre a biologia e a patobiologia da alfa-sinucleína. Ciência. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotor &alfa;-sinucleína A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. As células de levedura fornecem informações sobre a biologia e a patobiologia da alfa-sinucleína. Ciência. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 < / em>promotor &alfa;-sinucleína E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. As células de levedura fornecem informações sobre a biologia e a patobiologia da alfa-sinucleína. Ciência. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 < / em>promotor &alfa;-sinucleína WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. As células de levedura fornecem informações sobre a biologia e a patobiologia da alfa-sinucleína. Ciência. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservatório	SPL	23050
Espectrofotômetro	eppendorf	6131 05560
W303a			Presente da James Bardwell
Yeast nitrogen base sem aminoácidos	Difco	291940
Suplementos de meio drop-out sintético de levedura sem uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00