O avanço do estudo da foliculogênese pré-antral requer métodos eficientes de isolamento do folículo a partir de ovários únicos. Apresenta-se aqui um protocolo mecânico simplificado para isolamento folículo de ovários bovinos usando um cortador de tecido e homogeneizador. Este método permite a coleta de um grande número de folículos pré-antrais viáveis de um único ovário.
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Artigo de método
Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender todo o processo de foliculogênese de mamíferos é crucial para melhorar as tecnologias de reprodução assistida em gado, humanos e espécies ameaçadas de extinção. A pesquisa tem sido limitada principalmente a folículos pré-antrais grandes e antrais devido à dificuldade no isolamento de folículos pré-antrais menores, especialmente em mamíferos de grande porte, como bovinos. Este trabalho apresenta uma abordagem eficiente para recuperar um grande número de pequenos folículos pré-antrais de um único ovário bovino. O córtex de ovários bovinos individuais foi cortado em cubos de 500 μm usando um helicóptero de tecido e homogeneizado por 6 min a 9.000-11.000 rpm usando uma sonda de 10 mm. Grandes detritos foram separados do homogeneizado com pano de queijo, seguido de filtração seriada através de filtros celulares de 300 μm e 40 μm. O conteúdo retido no filtro de 40 μm foi enxaguado em um prato de busca, onde os folículos foram identificados e coletados em uma gota de meio. A viabilidade dos folículos coletados foi testada por meio da coloração azul de tripano. Este método permite o isolamento de um grande número de pequenos folículos pré-antrais viáveis de um único ovário bovino em aproximadamente 90 min. É importante ressaltar que este método é totalmente mecânico e evita o uso de enzimas para dissociar o tecido, o que pode danificar os folículos. Os folículos obtidos com este protocolo podem ser utilizados para aplicações a jusante, como isolamento de RNA para RT-qPCR, imunolocalização de proteínas específicas e cultura in vitro .
Introdução
Os folículos ovarianos são as unidades funcionais do ovário, responsáveis pela produção do gameta (ovócito), bem como hormônios críticos para a função reprodutiva e a saúde geral. Os folículos primordiais se formam no ovário durante o desenvolvimento fetal ou no período neonatal, dependendo da espécie1, e constituem a reserva ovariana de uma fêmea. O crescimento folicular começa com a ativação de folículos primordiais que deixam a piscina de repouso e entram na fase de crescimento. A foliculogênese pré-antral, abrangendo todos os estágios do folículo antes do desenvolvimento do antro, é um processo altamente dinâmico que requer alterações morfo....
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Protocolo
Os ovários bovinos (Bos taurus) foram obtidos de um matadouro local e transportados para o laboratório no prazo de 6 h após a recolha. Devido ao grande número de animais processados na instalação, a idade, a raça e o estágio do ciclo do cio dos animais são desconhecidos. Como nenhum animal vivo foi usado nesses experimentos, um protocolo aprovado de cuidado e uso de animais não foi necessário.
1. Preparação de equipamentos e reagentes
- Cubra uma seção de 2 pés de largura de uma bancada de laboratório com papel de bancada.
- Obter um cabo de bisturi, lâmina de bisturi estéril, hemostato, par de pinç....
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Resultados
Visão geral e etapas críticas
Usando este protocolo, pequenos folículos pré-antrais bovinos podem ser isolados de forma confiável de ovários únicos em números experimentalmente relevantes. De um total de 30 repetições, obteve-se uma média de 41 folículos por repetição, com variação de 11 a 135 folículos (Figura 4A). Em 14 repetições, os folículos foram caracterizados para o estágio de desenvolvimento conforme descrito anteriormente26 pela medição d.......
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Discussão
O presente protocolo detalha um método reprodutível para recuperar folículos pré-antrais em estágio inicial, especificamente nos estágios primário e secundário inicial, do ovário bovino. Este protocolo baseia-se em relatórios anteriores 20,25,30,34,35,36 e fornece otimizações que resultam no isolamento de um número significativo de folículos de um ovário individual........
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este projeto foi parcialmente financiado pelo projeto multiestadual do USDA W4112 e pelo prêmio UC Davis Jastro Shields à SM.
Os autores gostariam de estender seu apreço à Central Valley Meat, Inc. por fornecer os ovários bovinos usados em todos os experimentos. Os autores também agradecem a Olivia Silvera pela assistência com o processamento do ovário e isolamento do folículo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipeta Pasteur de Vidro Descartável de Cal Sodada 5-3/4" | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pipeta Pasteur que pode ser usada para desalojar folículos de detritos enquanto procura dentro da placa de Petri |
| 16% Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 15710 | Diluído a 4%; fixação de folículos para imunocoloração |
| 20 mL Seringa Luer-lock | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Seringa usada com a agulha 18 G para desalojar os folículos do 40 μ Filtro de célula m |
| #21 Lâmina de bisturi estéril | Fisher Scientific | 50-365-023 | Usado para cortar os ovários e remover a medula |
| 40 μ Filtro de Células m | Fisher Scientific | 22-363-547 | Usado para filtrar o filtrado do 300 μ Filtro de célula m |
| 104 mm Funil de Plástico | Fisher Scientific | 10-348C | O tamanho pode variar, mas certifique-se de que o pano de queijo seja cortado adequadamente e que o homogenato ovariano não derrame mais de |
| 300 μ m Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Usado para filtrar o filtrado do pano de queijo |
| Frasco Erlenmeyer de 500 mL | Fisher Scientific | FB500500 | Funil e frasco usados para pegar filtrado do pano de queijo |
| Agulhas Estéreis Air-Tite 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G oferece pressão suficiente para desalojar os folículos dos 40 μ |
| Agulhas Estéreis Air-Tite 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Agulhas que podem ser usadas para manipular quaisquer detritos nos quais os folículos estão presos |
| BD Hoechst 33342 Solução | Fisher Scientific | BDB561908 | Coloração de DNA Fluorescente |
| Soro Bovino Albumina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Componente do meio de lavagem do folículo |
| Ciências | Microscopia Eletrônica de Pano | 71748-00 | Primeira etapa de filtragem do homogenato ovariano destinada a remover grandes detritos de tecido |
| Lâminas de barbear de segurança de borda dupla clássica Lâminas de barbear | Wilkinson Sword | N/A | que se encaixam melhor no picador de tecidos McIlwain e não embotam rapidamente |
| Anticorpo secundário anti-coelho Burro, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Anticorpo secundário para imunocoloração |
| Eisco Latex Pipeta Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Bulbo de borracha para usar com pipetas Pasteur |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Componente do meio de lavagem do folículo |
| Homogeneizador | VWR | 10032-336 | Homogeneizar o tecido ovariano para liberar folículos |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software usado para análise de fluorescência-imunolocalização |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Usado para cortar tecido ovariano pequeno o suficiente para homogeneização |
| Microscópio - Estereoscópio | Olympus | SZX2-ILLT | Microscópio de dissecção usado para pesquisar e colher folículos do filtrado |
| Microscópio - Nikon invertido | Diaphot 300 | Microscópio invertido utilizado para visualização de campo claro de alta ampliação de folículos isolados | |
| Microscópio - Invertido | ECHO | Revolve R4 | Microscópio invertido utilizado para visualização de campo claro de alta ampliação e epifluorescência de folículos isolados |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Óleo para cobrir as gotas do meio de lavagem folicular para evitar a evaporação durante a pesquisa |
| Aminoácidos não essenciais (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Componente do meio de lavagem folicular |
| Soro de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagente para tampão de bloqueio de imunocoloração |
| Nunc 4-well Pratos para FIV | Thermo Fisher Scientific | 144444 | pratos de 4 poços para isolamento e lavagem |
| folículos Solução de Penicilina-Estreptomicina 100x | Gibco | 15-140-122 | Componente do meio de lavagem folicular |
| Placa de Petri 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Placa de Petri que se encaixa melhor no McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Tampão de lavagem para ovários e folículos |
| Corte de Plástico | Fisher Scientific | 09-002-24A Tábua | de corte de tamanho suficiente para cortar com segurança ovários |
| Polivinilpirrolidona (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | A adição de PVP (0,1% p/v) ao PBS impede que os folículos grudem na placa ou uns nos outros |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Meio de montagem para células ou tecidos marcados com fluorescência |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Kit de limpeza de coluna de RNA |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Software de análise estatística |
| Anticorpo Policlonal Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 | Abcam | ab181701 | Cx37 anticorpo primário para imunocoloração |
| RevertAid RT Kit de Transcrição Reversa | Thermo Fisher Scientific | K1691 | kit de síntese de cDNA |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Software de análise estatística |
| Solução de Hidróxido de Sódio (1N/Certificado) | Fisher Scientific | SS266-1 | Usado para aumentar o pH do meio para 7,6-7,8 |
| Piruvato de Sódio (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Componente do meio de lavagem folicular |
| Placa de Petri Quadrada 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Placas de Petri gradeadas permitem uma identificação mais eficiente dos folículos |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix para reação de PCR |
| Filtro de topo de garrafa rosqueado Steritop | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Usado para esterilizar o meio de lavagem do folículo |
| Coloração de gel de DNA seguro para SYBR | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Coloração para produtos de PCR visual em gel de agarose |
| TCM199 com Hank' s Sais | Gibco | 12-350-039 | Componente do meio de lavagem folicular |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergente para tampão de permeabilização de imunocoloração |
| Reagente Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | reagente de isolamento de RNA |
| Solução azul de tripano, 0,4% | Gibco | 15-250-061 | Usado para testar a viabilidade de folículos isolados |
| Tween 20 | Detergente para imunocoloração tampão de lavagem | ||
| Placa Aquecedor Universal | WTA | 20931 | Placa quente para manter os folículos a 38,5 ° C enquanto procurava ao microscópio |
| Micropipetas de vidro Wiretrol II Calibrated Drummond | 50002-005 | para manipular folículos |
Referências
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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Reimpressões e permissões
