Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

Resumo

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Resumo

A fidelidade da meiose de ovócitos é fundamental para a geração de ovos euploides competentes em termos de desenvolvimento. Nos mamíferos, o ovócito sofre uma longa prisão na prófase I da primeira divisão meiótica. Após a puberdade e após a retomada meiótica, a membrana nuclear se desmonta (quebra do envelope nuclear), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito. O posicionamento inicial do fuso central é essencial para proteger contra ligações anormais de cinetocócoro-microtúbulo (MT) e aneuploidia. O fuso posicionado centralmente migra de maneira sensível ao tempo em direção ao córtex, e esse é um processo necessário para extrudar um minúsculo corpo polar. Nas células mitóticas, o posicionamento do fuso depende da interação entre os MTs astrais mediados pelo centrossomo e o córtex celular. Pelo contrário, os ovócitos de camundongos não possuem centrossomos clássicos e, em vez disso, contêm numerosos centros organizadores de MT acentriolares (MTOCs). No estágio de metáfase I, os oócitos de camundongos têm dois conjuntos diferentes de MTOCs: (1) MTOCs que são agrupados e classificados para montar polos fusiformes (MTOCs polares) e (2) MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs) que permanecem no citoplasma e não contribuem diretamente para a formação do fuso, mas desempenham um papel crucial na regulação do posicionamento do fuso e na migração oportuna do fuso. Aqui, um método de ablação a laser multifóton é descrito para esgotar seletivamente mcMTOCs endogenamente marcados em oócitos coletados de camundongos repórteres Cep192-eGfp . Este método contribui para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao posicionamento e migração do fuso em ovócitos de mamíferos.

Introdução

Os gametas haploides (espermatozoides e ovócitos) são produzidos através da meiose, o que implica uma rodada de replicação do DNA seguida por duas divisões consecutivas que são necessárias para a redução do número cromossômico antes da fertilização. Em mamíferos, durante o início da vida fetal, o ovócito sofre uma longa parada (até a puberdade) no estágio diploteno da prófase I da primeira divisão meiótica, um estágio chamado estágio vesícula germinal (GV). Após a retomada meiótica, o ovócito GV sofre quebra do envelope nuclear (NEBD), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito ^1,2,3. Posteriormente, impulsionado pela F-actina, o fuso migra em tempo hábil do centro do ovócito para o córtex para garantir uma divisão altamente assimétrica, resultando em um ovo com um minúsculo corpo polar (PB)^4,5,6.

Nas células mitóticas, os centrossomos consistem em um par de centríolos circundados por componentes de material pericentríolo (PMC), como pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep192⁷. Esses centrossomos contendo centríolos contribuem para a fidelidade da formação do fuso bipolar⁸. No entanto, os centríolos são perdidos durante a oogênese precoce em várias espécies, incluindo roedores⁹. Portanto, os ovócitos de camundongos adotam uma via de montagem de fuso independente de centríolo utilizando numerosos centros organizadores de microtúbulos acentriolares (MTOCs)^9,10. Após a retomada meiótica, os MTOCs perinucleares passam por três etapas distintas de recondensação, alongamento e fragmentação em um grande número de MTOCs menores^11,12. Os MTOCs fragmentados são então agrupados e classificados para organizar um fuso bipolar^10,13,14. Outro pool de MTOCs está localizado no citoplasma durante o NEBD. Alguns desses MTOCs citoplasmáticos migram e formam polos fusiformes (MTOCs polares, pMTOCs)^10,11. Recentemente, outro subconjunto de MTOCs citoplasmáticos foi descoberto, denominado MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs), que não contribuem para a formação de polos fusiformes, mas permanecem no citoplasma de ovócitos durante a metáfase I (Met I)¹⁵. O esgotamento dos mcMTOCs pela ablação a laser multifótons ou o aumento anormal de seu número pela inibição da autofagia perturba o posicionamento e a migração do fuso e aumenta a incidência de aneuploidia em ovócitos da metáfase II¹⁵.

Curiosamente, os mcMTOCs diferem dos pMTOCs em muitos aspectos¹⁵. Por exemplo, em contraste com os pMTOCs, que se originam principalmente de MTOCs perinucleares, os mcMTOCs se originam do córtex de ovócitos. Quando o fuso ainda está no centro do ovócito, os mcMTOCs estão localizados assimetricamente opostos ao lado para o qual o fuso migra para extrusão PB¹⁵. Os MTs semelhantes a astrais não podem alcançar o córtex na célula de ovócitos relativamente grande. Portanto, esses mcMTOCs nucleam MTs para ancorar o fuso (via MTOCs astrais) ao córtex. Essas descobertas sugerem um modelo no qual a força MT nucleada por mcMTOC neutraliza a força mediada por F-actina que impulsiona a migração do fuso em direção ao córtex. O equilíbrio entre essas duas forças opostas é essencial para regular o posicionamento do fuso central e a migração oportuna do^{fuso 15}.

Até o momento, todas as proteínas PMC examinadas (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora quinase A) localizam-se em ambos os pools MTOC: mcMTOCs e pMTOCs¹⁵. Portanto, não há abordagem química ou genética para perturbar seletivamente os mcMTOCs sem perturbar os pMTOCs. Essas limitações podem ser contornadas visando seletivamente os mcMTOCs com ablação a laser. Dentre as tecnologias baseadas em laser desenvolvidas para microablação, os lasers de femtossegundos multifótons pulsados apresentam grande potencial devido ao seu impacto de precisão limitado ao plano focal, à alta profundidade de penetração da luz infravermelha próxima e à fototoxicidade e danos térmicos reduzidos à célula^16,17,18. Este trabalho descreve uma abordagem seletiva para ablar mcMTOCs em ovócitos de camundongos usando um laser multifóton acoplado a um microscópio invertido.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Camundongos repórteres Cep192-eGFP fêmeas com idades entre 6-8 semanas de idade foram utilizados no presente estudo. Para gerar camundongos repórteres Cep192-eGFP , o reparo dirigido por homologia mediado por CRISPR/Cas9 foi usado para integrar o gene repórter EGFP no genoma do camundongo CF-1. O repórter do EGFP foi fundido no terminal C do Cep192 (componente integrante dos MTOCs)¹⁵. Para manter a colônia de camundongos, foram utilizados camundongos repórteres homozigotos Cep192-eGfp . Todos os animais foram mantidos em gaiolas (até quatro animais/gaiola) a 21 °C e 55% de umidade, com ciclo claro/escuro de 12 h e acesso ad libitum a alimentos e água.

1. Coleção de ovócitos do rato

1. Preparar o meio de cultura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB¹⁹, ver Tabela de Materiais) e incubá-lo a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite.
   NOTA: O meio CZB pode ser armazenado a 4 °C durante 1 mês (consulte o arquivo suplementar 1 para a composição da mídia).
2. Complementar o meio CZB com glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) (CZB + M) (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo na incubadora.
   NOTA: A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém os ovócitos presos na prófase I e impede a retomada meiótica²⁰.
3. Prepare o meio de coleta (meio essencial mínimo livre de bicarbonato, MEM) contendo 3 mg/mL de polivinilpirolidona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Arquivo Suplementar 1) e milrinona (2,5 mM) (MEM/PVP + M, consulte a Tabela de Materiais).
4. Preparar os pratos de coleta e cultura, fazer quatro microgotas (100 μL) de meio de coleta (MEM/PVP + M) e duas microgotas (100 μL) de meio de cultura (CZB + M) em placas de Petri de 60 mm e 35 mm, respectivamente, e cobri-las com óleo mineral (ver Tabela de Materiais). Mantenha o prato de coleta na lâmina mais quente e coloque o prato de cultura na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
5. Injetar por via intraperitoneal 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG, ver Tabela de Materiais) em ratas fêmeas Cep192-eGFP sexualmente maduras (6-8 semanas de idade) 44-48 h antes da recolha de ovócitos.
6. Sacrificar os camundongos por luxação cervical, identificar e remover os ovários²¹ e transferi-los para um vidro de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido (MEM/PVP + M) a 37 °C.
7. Fixe o ovário tocando uma seringa de 1 ml no fundo do vidro do relógio e perfurando-o várias vezes (~ 40 vezes por ovário) usando agulhas de costura agrupadas para liberar os oócitos no meio.
8. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira todo o meio que contém os complexos cumulus-ovócitos (COCs) da etapa 1.7 para uma placa de Petri de plástico vazia de 100 mm.
9. Sob um estereomicroscópio, colete os COCs usando uma pipeta de vidro Pasteur e transfira-os para o prato de coleta que contém MEM / PVP + M.
10. Usando uma pipeta de vidro Pasteur estreita (aproximadamente 100 μm de diâmetro), desnude os oócitos mecanicamente por pipetagem repetitiva suave, seguida de transferi-los e lavá-los em quatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (o prato de coleta) antes de sua transferência para o prato de cultura CZB + M.
11. Incubar os ovócitos desnudados durante 1 h a 37 °C com 5% de CO₂ no ar.

2. Microinjeção de ovócitos

1. Coloque uma gota de 250 μL de MEM/PVP + M em uma tampa de placa de Petri de plástico de 100 mm e cubra-a com óleo mineral.
   NOTA: A tampa da placa de Petri tem um aro inferior que fornece mais espaço para ajustar o micromanipulador.
2. Ligue o sistema de microinjeção (consulte a Tabela de Materiais).
3. Colocar a placa de microinjeção na fase de aquecimento (37 °C) do microscópio.
4. Carregue a agulha de injeção com 0,5 μL de cRNA mCh-Cep192usando as pontas da pipeta do microcarregador (consulte Tabela de Materiais) e prenda a agulha de injeção ao micromanipulador.
5. Transferir os ovócitos desnudos (etapa 1.11) para a microgota de 250 μL (etapa 2.1).
6. Sob uma lente objetiva de 20x ou 40x, ajuste a posição e o foco das agulhas de injeção e de retenção de acordo com a posição do ovócito (Figura 1).
7. Configure a unidade de microinjeção e defina a pressão de injeção (p i), a pressão de compensação (p_c) e o tempo de injeção (t_i) para poder injetar 5-10 pl de cRNA mCh-Cep192 (para rotular exogenamente os MTOCs).
8. Injete cuidadosamente os oócitos sem tocar no núcleo.
9. Uma vez que todos os ovócitos são injetados, lave-os em três microgotas de CZB + M, transfira-os para a placa de cultura (CZB + M) e incube-os por 3 h a 37 °C para permitir a expressão de mCh-Cep192.

3. Maturação dos ovócitos

1. Preparar o meio de maturação adicionando glutamina (1 mM) a um meio CZB pré-equilibrado numa incubadora com 5% de CO₂ no ar a 37 °C durante, pelo menos, 3 h.
2. Faça duas microgotas (100 μL) do meio de maturação em uma placa de Petri de 35 mm e cubra-as com óleo mineral (placa de maturação).
3. Lave os ovócitos presos à prófase I pelo menos três vezes em microgotas de CZB isentas de milrinona de 100 μL para remover completamente a milrinona e permitir a retomada meiótica.
4. Transferir os ovócitos para a placa de maturação e incubá-los por 5 h (estágio de prometáfase I) em incubadora umidificada com 5% de CO₂ em ar a 37 °C.

4. Preparação de ovócitos para ablação e imagem

1. Transferir os ovócitos da prometáfase I (etapa 3.4) para uma placa de cultura com fundo de vidro contendo 100 μL de meio de maturação (etapa 3.1) coberto com óleo mineral.

5. Preparação do microscópio para ablação

1. Pelo menos 30 min antes da ablação, ligue o controlador de temperatura da incubadora de palco (ver Tabela de Materiais) e fixe-o a 37 °C.
2. Ligue o controlador de CO 2 e defina-o em 5% de CO₂.
3. Selecione uma objetiva apocromática de imersão em óleo de 40x e aplique uma pequena gota do óleo de imersão.
4. Monte o prato de cultura com fundo de vidro com os oócitos em uma incubadora de topo de palco e cubra a incubadora com uma tampa de gás.
5. No software de aquisição de imagens (consulte a Tabela de Materiais), selecione uma opção que permita salvar várias posições de estágio (por exemplo, "Definir marca e encontrar experimento"). Usando a iluminação de campo brilhante de luz transmitida, centralize nos ovócitos individuais e salve suas posições.
6. No software de aquisição de imagens, selecione o modo de digitalização XYZ , defina o formato da imagem como 256 x 256 pixels, defina o fator de zoom como 2,5x - 3,0x e selecione uma frequência de digitalização de 600 Hz. Isso corresponde a um tempo de permanência de pixels de aproximadamente 1,6 μs.
7. Defina uma linha de laser de excitação de 488 nm a aproximadamente 10% da potência do laser (o que corresponde a 4,0 μW no nível da amostra) (veja Tabela de Materiais) e use uma largura de banda espectral de 500-550 nm para observar o sinal GFP dos MTOCs. Para a observação simultânea da fluorescência do Cep192 marcado com mCherry, defina uma linha de laser de excitação de 585 nm em aproximadamente 8% da potência do laser (o que corresponde a 10,7 μW no nível da amostra) e use outro detector ajustado para uma largura de banda espectral de 595-645 nm.
   NOTA: É útil usar o detector de luz transmitida (TLD) do microscópio confocal para detectar simultaneamente os limites dos ovócitos.
8. Usando um modo de varredura ao vivo e o controle manual da unidade z, filtre o ovócito para MTOCs.
9. Uma vez que um mcMTOC é detectado, desenhe uma região quadrada de interesse (ROI) em torno dele.

6. Ablação de mcMTOCs

1. Defina um laser de femtossegundo para um comprimento de onda de 740 nm.
   NOTA: O comprimento de onda do laser pode ser alterado de acordo com o microscópio e as condições do laser.
2. Use o modulador eletro-óptico do microscópio multifóton (ver Tabela de Materiais) para definir a potência do laser para 70%-80%, correspondendo à potência de 60-70 mW no plano da amostra.
   NOTA: Se o laser estiver equipado com um compensador de pulso de femtossegundos, use-o para corrigir a dispersão de atraso de grupo (GDD). A correção de GDD reduz a quantidade de energia do laser necessária para uma ablação eficiente do mcMTOC e minimiza os fotodanos ao ovócito. O controle GDD é geralmente integrado com o software de aquisição de imagem de microscópios multifótons comerciais.
3. Use o mesmo formato de imagem, fator de zoom e frequência de digitalização como na etapa 5.6. Defina os parâmetros de média de linha e quadro como 1.
4. Clique no botão Scan no software para realizar a ablação do mcMTOC realizando uma única varredura a laser do ROI selecionado.
5. Use as configurações de canal da etapa 5.7 para revisar os resultados da ablação comparando as imagens das estruturas marcadas com GFP tiradas antes e depois da exposição ao laser multifóton. Se a ablação for bem-sucedida, a intensidade da fluorescência da GFP no mcMTOC alvo diminui para os níveis observados no fundo.
6. Se alguns fragmentos de uma estrutura de marcação GFP permanecerem, repita a etapa 6.4 uma ou mais vezes, concentrando-se em vários planos z do mcMTOC.
7. Use as configurações de canal da etapa 5.7 para verificar a eficiência da ablação pela perda completa de sinais mCherry associados ao mcMTOC (mCh-Cep192).
8. Repita a etapa 5.8 para a etapa 6.7 até que todos os MTOCs de um ovócito (em vários planos focais) sejam ablados.
   NOTA: Este protocolo usa a microinjeção mCh-Cep192 como uma estratégia para confirmar a depleção de mcMTOC após a exposição ao laser multifóton e excluir a possibilidade de que a perda de fluorescência de GFP seja causada pelo fotobranqueamento de GFP. No entanto, a microinjeção desta sonda é opcional e não é necessária para o procedimento de ablação.

Resultados

A ablação a laser multifóton fornece um método eficiente para ablar seletivamente estruturas intracelulares. O presente estudo empregou a ablação a laser multifóton para esgotar mcMTOCs em oócitos de camundongos seletivamente. A ablação a laser esgotou os mcMTOCs de forma eficiente, como demonstrado pela redução da fluorescência endógena de GFP nos mcMTOCs alvo para um nível comparável ao fundo. O mCh-Cep192 exógeno nos mcMTOCs alvo também foi abolido após a ablação a laser. A ablação a laser de mcMTOCs deve ser realizada em diferentes planos focais dentro do ovócito (onde os mcMTOCs estão localizados, Figura 2) para garantir que todos os mcMTOCs dentro do ovócito estejam esgotados (Figura 3).

Figura 1: Microinjeção de ovócitos. Microinjeção de um ovócito de camundongo preso por prófase I com cRNA mCh-Cep192 . Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Depleção de mcMTOCs em ovócitos de ratinhos. Imagens representativas de planos focais únicos. Os quadrados brancos indicam um mcMTOC antes e depois da ablação a laser multifóton. Barra de escala: 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Depleção de mcMTOCs em diferentes planos focais em um ovócito de camundongo. Imagens de projeção máxima representativas de um ovócito de rato ablado-mcMTOC. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Composições de Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e meio essencial mínimo livre de bicarbonato (MEM/PVP). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Existem diferentes métodos para perturbar as estruturas relacionadas ao citoesqueleto dentro das células^22,23,24,25. No entanto, encontrar técnicas eficientes para perturbar seletivamente a estrutura alvo sem comprometer a viabilidade celular é um desafio. O método de ablação a laser multifóton aqui apresentado é uma estratégia eficiente para induzir uma perturbação mecânica seletiva aos mcMTOCs dentro do ovócito sem alterar a viabilidade do ovócito.

A ablação a laser tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos moleculares que controlam a segregação cromossômica durante a mitose e meiose^22,23,26,27. Devido ao tamanho relativamente grande (>80 mm de diâmetro) dos ovócitos de mamíferos em comparação com as células somáticas²⁸, a ablação de suas estruturas intracelulares representa um desafio. Além disso, o volume médio de mcMTOC em ovócitos de metáfase I é de ~20 μm¹⁵, representando um desafio adicional. Um método eficiente que ofereça uma penetração tecidual mais profunda deve ser adotado para superar esses desafios. A principal vantagem do uso do laser multifóton para ablação é sua capacidade de penetrar mais profundamente na célula, minimizando os efeitos fora do alvo²⁹.

Para verificar a eficácia e a eficiência do método de ablação a laser para esgotar a estrutura alvo, recomenda-se o uso de uma proteína marcada fluorescentemente para identificar a estrutura alvo ao longo do tempo (antes e após a ablação)²³. É importante notar que a ablação a laser esgota todo o mcMTOC como estrutura e, embora mcMTOCs menores exijam apenas uma única exposição ao laser para serem esgotados, mcMTOCs maiores podem exigir mais de uma exposição a laser em diferentes planos focais. Recomenda-se também fixar e imunomarcar um subconjunto de oócitos ablados-mcMTOC e de controle com um marcador MTOC (como γ-tubulina, pericentrina ou Cep192) para confirmar ainda mais a eficiência da ablação mcMTOC. Nos ovócitos de controle, áreas do citoplasma adjacentes, mas não sobrepostas aos mcMTOCs, serão expostas ao laser.

Este experimento requer várias ablações mcMTOC enquanto se move entre diferentes planos focais dentro dos ovócitos. Portanto, é altamente recomendável praticar essa técnica várias vezes antes de executar o experimento para minimizar o tempo de experimento, aumentando assim a viabilidade dos ovócitos. Além disso, é importante usar a potência mínima do laser que seja suficiente para esgotar os mcMTOCs sem afetar a viabilidade dos ovócitos.

Esta técnica tem algumas limitações. Primeiro, os microscópios confocais multifótons são relativamente mais caros do que os microscópios confocais regulares. Em segundo lugar, perturbar todos os mcMTOCs em diferentes planos focais é mais demorado do que perturbações químicas ou genéticas. Em terceiro lugar, este protocolo requer habilidades técnicas para ablar todos os mcMTOCs no menor tempo possível. No entanto, uma vez dominado, o uso do laser multifóton fornece uma excelente estratégia para perturbar várias estruturas intracelulares em ovócitos de camundongos, incluindo mcMTOCs, contribuindo para a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o posicionamento do fuso e sua migração oportuna em ovócitos de mamíferos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID	Instrumento de precisão mundial	Agulhas de injeção TW100F-4
Vidro borossilicato	Marca Fisher	Cat# 13-678-20D
Capilaridades de vidro borossilicato	Instrumento de Precisão Mundial	Cat# TW100-6	Segurando agulhas
Albumina de soro bovino	MilliporeSigma	Cat# A4503
Incubadora de gaiola para microscópio Leica DMI6000 B	Life Imaging Services GmbH
Cálcio di-hidratado	MilliporeSigma	Cat# C7902
CO2 controlador	Pecon	# 0506.000
CO2 Capa HP	Pecon	# 0506.020
Ácido DL-Láctico	MilliporeSigma	Cat# L7900
DMi8	Leica	Microscópio N/A
EDTA	MilliporeSigma	Cat# E5134
Femtojet 4i	Eppendorf	/A	Microinjetor
Microcarregador Femtotips	Fisher scientific
Gentamicina	MilliporeSigma	Cat# G1272
Gentamicina	MilliporeSigma	Cat# 1272
Prato com fundo de vidro	Mat Tek Corporation	Cat# P35G-1.0-20-C
Hepes	MilliporeSigma	Cat# H3784
Hepes Sal de Sódio	MilliporeSigma	Cat # H3784
Hera Cell vios 160i	Thermo	N/A	CO2 incubadora
Micorscope confocal de varredura a laser espectral Leica TCP SP8 com suporte invertido DMI6000 B	Leica Microsystems, Inc	N/A
L-Glutamina	MilliporeSigma	Cat#G8540
Sulfato de magnésio dihidratado	MilliporeSigma	Cat# M7774
MaiTai DeepSee Ti-Safira laser de femtosegundo	Spectra-Physics	N/A
mCH-Cep192 cRNA		N/A
Médio Essencial Médio Médio Águia - MEM	MilliporeSigma	Cat #M0258
Milrinone	MilliporeSigma	Cat# M4659
Óleo mineral	MilliporeSigma	Cat# M5310
Águia média essencial mínima (MEM)	MilliporeSigma	Cat# M0268 - Mouse 1L
: Cep192-eGFP repórter CF-1		N/A
Placa de Petri (100 mm)	Fisherbrand	Placa de Petri Cat# FB0875712
(35 mm)	Corning	Placa de Petri Cat# 430165
(60 mm)	Falcon	Cat# 351007
Fenol Vermelho	MilliporeSigma	Cat# P5530
Polivinilpirolidone	MilliporeSigma	Cat# P2307
Polivinilpirolidone (PVP)	MilliporeSigma	Cat# P2307
Cloreto de potássio	MilliporeSigma	Cat# P5405
Fosfato de potássio monobásico	MilliporeSigma	Cat# P5655
Égua grávida&aguda; s gonadotrofina sérica	Lee BioSolutions	Cat# 493-10-10
Ácido pirúvico	MilliporeSigma	Cat# P4562
Ácido pirúvico	MilliporeSigma	Cat# P4562
Agulhas de costura	D.M.C	N/A	N° 5 * 16 Agulhas
Bicarbonato de sódio	MilliporeSigma	Cat# S5761
Cloreto de sódio	MilliporeSigma	Cat# S5886
Inserção de aquecimento de palco P	Pecon	# 0426.300
Sterezoom S9i	Leica	Estereomicroscópio N/A
Seringa 1 mL	BD company	Gato# 309597
Taurina	MilliporeSigma	Cat# T0625
Controlador de temperatura Tempcontrol 37-2 digital	Pecon	# 0503.000
O controlador de temperatura Cube para a incubadora de gaiolas	Life Imaging Services GmbH