Relatamos uma câmara ambiental flexível e de estágio para obtenção de imagens de lapso de tempo de células vivas usando microscopia de espalhamento Raman estimulada vertical com detecção de sinal transmitido. As gotículas lipídicas foram fotografadas em células SKOV3 tratadas com ácido oleico por até 24 h com um intervalo de tempo de 3 min.
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Artigo de método
Uma câmara flexível para imagens de células vivas com lapso de tempo com microscopia de espalhamento Raman estimulada
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de marcação. A imagem de células vivas com SRS tem sido demonstrada para muitas aplicações biológicas e biomédicas. No entanto, a imagem de longo prazo com SRS de lapso de tempo de células vivas não tem sido amplamente adotada. A microscopia SRS geralmente usa uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica (NA) e um condensador de imersão em óleo de alto NA para obter imagens de alta resolução. Neste caso, o espaço entre a objetiva e o condensador é de apenas alguns milímetros. Portanto, a maioria das câmaras ambientais comerciais de topo de palco não pode ser usada para imagens SRS devido à sua grande espessura com uma cobertura de vidro rígida. Este artigo descreve o projeto e a fabricação de uma câmara flexível que pode ser usada para imagens de células vivas com lapso de tempo com detecção de sinal SRS transmitido em um quadro de microscópio vertical. A flexibilidade da câmara é alcançada usando um material macio - uma fina película de borracha natural. O novo design do gabinete e da câmara pode ser facilmente adicionado a uma configuração de imagem SRS existente. Os testes e os resultados preliminares demonstram que o sistema de câmara flexível permite imagens SRS estáveis, de longo prazo e com lapso de tempo de células vivas, que podem ser usadas para várias aplicações de bioimagem no futuro.
Introdução
A microscopia óptica é utilizada para observar as microestruturas das amostras. A imagem óptica é rápida, menos invasiva e menos destrutiva do que outras tecnologias1. A imagem de células vivas com microscopia óptica é desenvolvida para capturar a dinâmica de células vivas cultivadas por um longo período2. Diferentes tipos de contrastes ópticos fornecem informações distintas sobre amostras biológicas. Por exemplo, a microscopia óptica de fase mostra a diferença sutil nos índices de refração ao longo da amostra3. A microscopia de fluorescência é amplamente utilizada para obter imagens de biomolécul....
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Protocolo
1. Construa o gabinete ambiental do microscópio
NOTA: Este grande gabinete ambiental do microscópio é usado para controlar a temperatura do corpo do microscópio e o ambiente de imagem a ser estabilizado em 37 °C (Figura 1A).
- Marque a localização dos pés do quadro do microscópio SRS e do estágio motorizado usando uma caneta marcadora na mesa óptica. Monte dois Diafragmas de Íris na frente do scanner Galvanômetro do microscópio e ajuste para fazer a bomba e os feixes de laser de Stokes passarem pelo centro dos Diafragmas de Íris.
- Remova a estrutura do microscópio e o estágio da mesa óptica.
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Resultados
Fabricamos e montamos o sistema de câmara flexível para obtenção de imagens SRS com lapso de tempo (Figura 1 e Figura 2) e, em seguida, avaliamos o desempenho do sistema. A temperatura no interior do compartimento ambiente do microscópio atingiu os 37 °C esperados em 1 h, o que não afetou significativamente a temperatura ambiente (Figura 3A). A temperatura na câmara flexível atingiu 37 °C em 1,5 h, mantendo-se estável a 37 °C por pe.......
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Discussão
A microscopia SRS de células vivas com lapso de tempo é uma técnica alternativa de imagem para rastreamento de moléculas de maneira livre de marcação. Em comparação com a marcação por fluorescência, a imagem SRS é livre de fotoclareamento, permitindo o monitoramento de moléculas a longo prazo. No entanto, até o momento, o sistema de imagem de células vivas em uma microscopia SRS vertical não está disponível comercialmente. Neste trabalho, um sistema de imagem de células vivas com uma caixa de gabinete de microscópio com .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Queremos agradecer à Equipe de Design Sênior de Graduação de 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) da Universidade de Binghamton pelo projeto, fabricação e teste da caixa de gabinete do microscópio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas da Universidade de Binghamton pelas discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health sob o número de prêmio R15GM140444.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Um microscópio SRS construído em laboratório | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| Amplificador de bloqueio HF2LI de 50 MHz | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Diafragma de íris | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Montagem de espelho cinemático | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Moldura de microscópio | Nikon Inc | FN-1 | |
| Estágio de microscopia motorizado | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Condensador de imersão em óleo (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Objetiva de imersão em água (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materiais e peças para o gabinete do microscópio (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Módulo aquecedor Airtherm | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Controlador de aquecedor Airtherm, CO2 e monitor de umidade | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Módulo misturador de ar/CO2 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Mangueira de duto flexível (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Cerâmica de vidro-mica de alta temperatura, fácil de usinar (6'' x 6'', 1/4'' de espessura) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Folhas de policarbonato (espessura 0,25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Folhas de borracha de silicone (36'' x 36'', espessura 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materiais e peças para a câmara flexível | |||
| Placa quente | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| Filtro em linha de alta pureza, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Serra copo (diâmetro de corte 1-7/8 polegada) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Serra copo (diâmetro de corte 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Tubo de borracha de silicone de alta temperatura, macio, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Filtro em linha (1/4 NPT, 40 mícron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Tubo redondo de alumínio multiuso 6061 (espessura da parede de 1/8'', 4' ' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Tubo redondo de alumínio 6061 multiuso (espessura de parede de 3/4'', 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| (12'' x 12'', espessura 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Barra de alumínio 6061 multiuso (8'' x 8'', espessura 3/8' ') | Objetiva de objetiva McMaster-Carr | 9246K21 | |
| única) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Suporte de amostra (modificado) | HZ202 | Prior Scientific | |
| (espessura 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Frasco de vidro selável a vácuo | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | Software de imagem SRS | |
| Materiais para imagens de células vivas | |||
| Placas de cultura estéreis com fundo de vidro de cobertura (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Ciências de Microscopia Eletrônica (EMS) | 70674-02 | |
| Meio de cultura de células DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor corante fluorescente DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Ácido oleico | MilliporeSigma | 364525 | |
| Linha celular SKOV3 | ATCC | HTB-77 |
Referências
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
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Reimpressões e permissões
