aA raiva é uma encefalite viral aguda e progressiva. O agente etiológico em forma de bala pertence ao gênero Lyssavirus, pelo menos 17 dos quais causam raiva em todo o mundo (exceto na Antártica). O vírus da raiva é o membro mais importante desses diversos vírus de RNA. Todos os mamíferos são suscetíveis, com morcegos e mesocarnívoros sendo reservatórios significativos. A transmissão ocorre principalmente após uma mordida. Como agentes neurotrópicos por excelência, os vírions progridem centrípetos após a deposição via axônios da periferia para o sistema nervoso central (SNC) para replicação, depois para as glândulas salivares e são excretados na saliva. Globalmente, os cães são responsáveis pelo maior número de mortes humanas por raiva, causando dezenas de milhares de mortes anualmente. Considerando as dimensões zoonóticas, os métodos laboratoriais são essenciais para a pesquisa aplicada e notificação, prevenção e controle de doenças em humanos, animais domésticos e animais silvestres. O objetivo por trás desta coleção de nove artigos inter-relacionados é introduzir métodos que forneçam introspecção à ocorrência, detecção, patobiologia, epidemiologia, manejo e melhoria da raiva em produtos biológicos.
Como a raiva é avaliada? A raiva deve ser uma doença de notificação compulsória, com coleta, análise e interpretação epidemiológica adequadas dos dados. Hoje, a maioria dos casos é relatada por vigilância passiva, baseada em animais que expõem pessoas. Embora possa parecer razoavelmente simples imaginar a captura, contenção, sedação e eutanásia seguras de um suspeito clínico (ou seja, um cão mordendo para diagnóstico de raiva), isso não é tão fácil para alguns animais selvagens. Por exemplo, Taiwan era uma área considerada "livre" de raiva, originalmente baseada em extensa vigilância em animais domésticos. No entanto, reconhecendo a importância de outros reservatórios de animais, os investigadores da ilha voltaram sua atenção para a vida selvagem. Como Hsu et al. descrevem, a coleta direcionada de morcegos moribundos e mortos oferece uma oportunidade para a detecção de espécies únicas de lyssavirus em Taiwan1. Tais esforços expandiram a amplitude taxonômica desse gênero viral e forneceram um esquema razoável para outras avaliações na Ásia.
Quais tecidos são necessários para o diagnóstico do lyssavirus? Além da derivação de métodos de vigilância relevantes e da identificação correta das espécies, a seleção segura e apropriada de tecidos é fundamental para o diagnóstico sensível e específico da raiva. Desde oséculo 19, o sistema nervoso central (SNC) foi apreciado como um tecido primário. Os animais foram sacrificados, suas carcaças foram enviadas para o laboratório, crânios foram abertos, cérebros foram removidos e porções examinadas microscopicamente em busca de inclusões virais. No entanto, o envio de animais inteiros não é prático, principalmente com mamíferos de grande porte, como o gado. Além disso, nem todas as áreas do cérebro são igualmente úteis para o diagnóstico. Jarvis et al. descrevem métodos de necropsia seguros e práticos para mamíferos pequenos e grandes que minimizam o risco de exposição e reduzem os tempos de processamento2. A aplicação de tais recomendações de biossegurança e a concentração no tronco encefálico e no cerebelo melhorarão as práticas de vigilância laboratorial moderna da raiva animal.
Quais opções são usadas para detecção de antígeno viral? Para o diagnóstico de rotina do lyssavirus, um teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) para a observação de inclusões virais no tecido do SNC tem sido usado desde meados doséculo 20. Embora altamente sensível e específico, o teste DFA requer um microscópio fluorescente e usa acetona como fixador de tecido. Patrick et al. relatam o uso de um teste imuno-histoquímico rápido e direto (drit) que se baseia na coleta de tronco encefálico, fixação de formalina nas impressões teciduais, uso de anticorpos monoclonais ou policlonais conjugados à biotina e detecção de inclusões virais por microscopia de luz, em menos de 1 hora3. O drit tem sensibilidade e especificidade semelhantes ao teste DFA e é adequado para vigilância laboratorial descentralizada e aprimorada em condições de campo. Para configurações de recursos limitados, um ensaio de fluxo linear (LFA) é outro método para diagnóstico rápido que requer conhecimento técnico mínimo, conforme relatado por Mauti et al.. As tiras de teste positivas do campo podem ser enviadas a um laboratório central para confirmação4.
Além da detecção de antígenos, outros métodos são adequados para o diagnóstico de lyssavirus? Os testes DFA, drit e LFA são úteis para a detecção de antígenos virais em tecidos do SNC post-mortem. No entanto, os tecidos cerebrais podem estar decompostos. Além disso, em casos humanos suspeitos, os testes antemortem são mais desejáveis e podem incluir amostras clínicas alternativas, como o LCR. Como tal, os ensaios moleculares são muito úteis para detectar pequenas quantidades de ácidos nucléicos virais. Marston et al. e Wang et al. descrevem uma técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real e aninhada, respectivamente, que é rápida, sensível e específica 5,6. Essa atenção cuidadosa aos detalhes para minimizar a contaminação da amostra e o design adequado do primer permitem o diagnóstico primário em todo o espectro de lyssavírus divergentes.
Uma vez diagnosticada, a microscopia convencional é adequada para insights modernos sobre a patobiologia do lyssavirus? O uso de métodos microscópicos bidimensionais por si só pode resultar na falta de elementos críticos in vivo no contexto e na complexidade. No entanto, usando objetivas de longa distância de trabalho livre, os tecidos infectados por vírus podem ser visualizados por microscopia confocal convencional de varredura a laser em altas resoluções, conforme detalhado por Zaeck et al., para visualizar a distribuição do patógeno e apreciar melhor os detalhes sobre patogênese viral, disseminação, tropismo e neuroinvasão7.
Existem alternativas para medir a potência da vacina anti-rábica? Os métodos atuais para medir a potência da vacina anti-rábica requerem um grande número de roedores de laboratório. No entanto, custos, intervalos de confiança e questões de bem-estar exigem uma alternativa. A glicoproteína do vírus da raiva provoca anticorpos neutralizantes do vírus após a vacinação. Conforme comunicado por Jallet e Tordo, um teste ELISA in vitro pode ser usado em vez de animais para medir o conteúdo relativo das vacinas contra o vírus da raiva, usando anticorpos monoclonais altamente específicos8.
A inferência sobre o consumo oral de iscas vacinais por animais selvagens pode ser realizada usando biomarcadores? Além da vacinação parenteral de humanos e animais domésticos, a vacinação oral de mesocarnívoros selvagens está em vigor desde a década de 1970. Além de medir a imunogenicidade da vacina ou a eficácia resultante entre populações de raposas, guaxinins, gambás, etc. por detecção de casos, os biomarcadores podem ser usados para inferir o contato e o consumo de iscas carregadas de vacinas. Historicamente, a detecção de tetraciclina incorporada em iscas era feita nos ossos ou dentes de animais. Uma alternativa à coleta desses tecidos duros é a dosagem sorológica de um biomarcador diferente, como o ácido iofenóxico. Berentsen et al. relatam as análises de tais derivados no soro de mangustos, um importante reservatório natural na Ásia, que foi introduzido na região do Caribe9. Após o consumo de iscas contendo esse biomarcador por mangustos em cativeiro, eles extraíram ácidos iofenóxicos em acetonitrila e analisaram soros animais por cromatografia líquida-espectrometria de massa. A marcação adequada foi detectada por várias semanas após o consumo da isca e esses derivados podem ser adequados para avaliação de campo da aceitação de isca carregada de vacina em animais de vida livre.
Devido em parte à pandemia de COVID-19 em andamento, métodos virológicos aprimorados na vigilância aprimorada do lyssavirus, descoberta de patógenos, diagnóstico confirmatório e caracterização de variantes são esperados. Ler sobre diferentes técnicas na literatura revisada por pares é normalmente o primeiro passo para um indivíduo interessado. No entanto, observar diretamente uma sequência de etapas e ouvir o contexto de um operador experiente remove nuances e interpretações errôneas. Os protocolos laboratoriais e de campo atuais e futuros relacionados à raiva, conforme recomendado pela OIE e pela OMS, podem se beneficiar de coleções adicionais de métodos visuais para auxiliar novos investigadores, especialmente em países em desenvolvimento.