Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.
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Artigo de método
Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a
Neste artigo
Resumo
Resumo
O aumento do uso de sequenciamento na medicina identificou milhões de variantes codificadoras no genoma humano. Muitas dessas variantes ocorrem em genes associados a distúrbios do neurodesenvolvimento, mas o significado funcional da grande maioria das variantes permanece desconhecido. O presente protocolo descreve o estudo de variantes para Ube3a, um gene que codifica uma ubiquitina ligase E3 ligada ao autismo e à síndrome de Angelman. A duplicação ou triplicação de Ube3a está fortemente ligada ao autismo, enquanto sua deleção causa a síndrome de Angelman. Assim, a compreensão da valência das alterações na atividade da proteína UBE3A é importante para os desfechos clínicos. Aqui, um método rápido, baseado em células, que emparelha variantes Ube3a com um repórter de via Wnt é descrito. Este ensaio simples é escalável e pode ser usado para determinar a valência e a magnitude das mudanças de atividade em qualquer variante do Ube3a . Além disso, a facilidade deste método permite a geração de uma riqueza de informações estrutura-função, que podem ser usadas para obter insights profundos sobre os mecanismos enzimáticos da UBE3A.
Introdução
Avanços tecnológicos recentes têm tornado rotineiro o sequenciamento de exomas e genomas em ambientes clínicos 1,2. Isso levou à descoberta de um grande número de variantes genéticas, incluindo milhões de variantes missense que normalmente mudam um aminoácido em uma proteína. Compreender o significado funcional dessas variantes continua sendo um desafio, e apenas uma pequena fração (~2%) das variantes de missense conhecidas tem uma interpretação clínica 1,3.
Um exemplo proeminente desse problema é o Ube3a, um gene que codifica uma ligase de ubiquitina E3 que tem como alvo proteínas de substrato para degradação4. Ube3a reside no cromossomo 15q11-13 e é expresso exclusivamente a partir do alelo herdado maternalmente 5,6,7. Observações da genética da doença sugerem fortemente que a atividade insuficiente ou excessiva da enzima UBE3A causa distúrbios distintos do neurodesenvolvimento. A deleção do cromossomo materno 15q11-13 causa síndrome de Angelman (EA)8, distúrbio caracterizado por deficiência intelectual grave, comprometimento motor, convulsões, comportamento feliz com sorriso frequente e características faciais dismórficas 8,9,10. Em contraste, a duplicação ou triplicação do cromossomo materno 15q11-13 causa a síndrome de Dup15q, uma condição heterogênea reconhecida como uma das formas sindrômicas mais prevalentes de autismo11,12,13. Além disso, existem centenas de variantes missense identificadas no Ube3a, a maioria das quais são consideradas variantes de significado incerto (USV), pois seu significado funcional e clínico são desconhecidos. Assim, há um interesse considerável no desenvolvimento de métodos que possam avaliar empiricamente as variantes do Ube3a para determinar se elas contribuem para a doença do neurodesenvolvimento.
A enzima UBE3A pertence à família de domínios HECT (homóloga ao E6-AP C-terminus) de ligases E3 ubiquitina que possuem o domínio homônimo HECT, que contém o maquinário bioquímico necessário para aceitar ubiquitina ativada de enzimas E2 e transferi-la para proteínas de substrato14. Historicamente, a caracterização das enzimas E3 tem se baseado em sistemas in vitro reconstituídos que requerem um conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tais métodos são lentos e trabalhosos e não são passíveis de avaliar a atividade de um grande número de variantes. Em trabalhos anteriores, o UBE3A foi identificado para ativar a via Wnt em células HEK293T, modulando a função do proteassoma para retardar a degradação da β-catenina17. Essa percepção permite o uso de repórteres de via Wnt como um método eficiente e rápido para identificar variantes de perda e ganho de função do Ube3a18. O protocolo abaixo descreve em detalhes um método para gerar variantes Ube3a, bem como um repórter baseado em luciferase para avaliar mudanças na atividade de variantes Ube3a.
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Protocolo
1. Clonagem de mutagênese para gerar variantes do Ube3a
- Clone todas as variantes de Ube3a no plasmídeo pCIG2 (Figura 1A), um vetor bicistrônico que contém um promotor de acetina β galinha e um local de entrada interno de ribossomo (IRES) para a expressão EGFP19. Construções Ube3a de comprimento total contêm uma sequência de N-terminal Myc-tag e são clonadas em pCIG2 usando um site SacI de 5' e um site XmaI de 3'. Além disso, os locais EcoRI, EcoRV e PstI que ocorrem naturalmente dentro da sequência de codificação Ube3a também são usados para subclonar fragmentos.
NOTA: Variantes não identificadas para Ube3a podem ser obtidas através da literatura e em repositórios acessíveis ao público, como o banco de dados ClinVar1. Variantes adicionais não relatadas podem ser obtidas através da comunicação pessoal com centros médicos. - Use um método de mutagênese megaprimer de duas etapas adaptado20 para introduzir mutações no quadro de leitura do Ube3a . Na primeira etapa, projete o oligonucleotídeo mutagênico que contém a mutação desejada (o exemplo mostrado neste protocolo é gerar uma variante UBE3A Q588E) ladeado por pelo menos 30 pares de bases (pb) de homologia 5′ e 3′ à mutação (Figura 1B e Tabela 1).
- Utilizar o oligonucleotídeo mutagênico juntamente com um oligonucleotídeo complementar para a primeira rodada de PCR para gerar um megaprimer de 200-400 pb contendo a mutação (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Use todos os 50 μL do volume de reação de PCR para eletroforese em gel de agarose usando um gel a 1% e subsequente purificação em gel (Tabela de Materiais). Eluir o produto de PCR em 30 μL de H 2 O deionizado (diH2O)para uso na segunda etapa de PCR abaixo da rodada.
- Configure a segunda rodada de PCR conforme indicado (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Esta etapa gerará fragmentos de DNA maiores (tipicamente ~1-1,5 kb de comprimento) contendo os locais de mutação e restrição terminal adequados para subclonagem (Figura 1C).
- Após a conclusão da reação de PCR, purifice o produto resultante usando um kit de purificação de PCR (Tabela de Materiais). Eluir em 30 μL e digerir todo o produto purificado e o construto pCIG2 Ube3a WT com as enzimas de restrição apropriadas (o exemplo mostra a digestão com EcoRI e XmaI).
- Após 2 h de digestão a 37 °C, resolver os produtos da digestão através da eletroforese em gel de agarose (gel a 1%) e purificar os produtos apropriados. Configure ligaduras de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais), transforme os produtos de ligadura em uma cepa bacteriana DH10B (Tabela de Materiais) e, em seguida, pratique com ampicilina (100 μg/mL) de seleção.
- No dia seguinte, escolha de duas a quatro colônias para inocular 3 mL de culturas contendo caldo de Luria (LB) e 100 μg/mL de ampicilina. Deixe as culturas crescerem durante a noite a 37 °C em uma incubadora orbital com agitação (225 rpm).
- No dia seguinte, use 1-1,5 mL da cultura bacteriana para minipreparar o DNA plasmidial (Tabela de Materiais). Salve a cultura restante colocando-a a 4 °C. Rastreie os plasmídeos minipreparados por sequenciamento de Sanger usando um oligonucleotídeo que se liga ~ 200 pb da mutação desejada.
- Use as culturas bacterianas salvas a 4 °C para re-inocular 50 mL de culturas para midiprep o plasmídeo correto (Tabela de Materiais). Sequencie completamente a sequência de codificação Ube3a para validar a sequência correta do DNA.
- Crie estoques de trabalho de plasmídeos variantes de Ube3a, bem como o repórter ativado por β-catenina (BAR)21, luciferase TK-Renilla, Ube3a morto de ligase (mutação UBE3A C820A) e vetor vazio pCIG2 a uma concentração de 100 ng/μL usando H2O estéril para as etapas de transfecção subsequentes.
2. Preparação e transfecção de células 293T embrionárias do rim humano (HEK293T)
- Realizar os ensaios em células HEK293T cultivadas em meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco pré-suplementado com glutamina, soro fetal bovino a 10% (FBS) e antibiótico-antimicótico, conforme descrito anteriormente17. Cultivar as células em uma incubadora estéril e umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
- Usando um gabinete de biossegurança, primeiro coloque as células HEK293T suspensas em placas de fundo plano de 96 poços tratadas com cultura de tecidos a uma densidade de 2,2 × 104 células por poço em 100 μL de meios de cultura e permita que elas cresçam durante a noite.
- No segundo dia, transfectar as células em um gabinete de biossegurança com plasmídeos repórteres Firefly e Renilla luciferase (Tabela 4) e plasmídeos Ube3a em triplicado. Realizar as transfecções em 10 μL de volume total por poço utilizando uma proporção de 10:1:8 de plasmídeos (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla e 40 ng de plasmídeo Ube3a por poço, respectivamente), conforme descrito anteriormente18, e 0,4 μL de reagente de transfecção (Tabela 4).
NOTA: Para cada experimento, um vetor vazio (somente GFP) e um plasmídeo codificando Ube3a morto por ligase também são transfectados para servir como controles negativos. - Criar uma mistura mestra para as transfecções para cada variante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Tabela 4) e incubar à temperatura ambiente (RT) por 15 min. Após a incubação, agite suavemente a mistura de transfecção batendo no tubo e, em seguida, adicione 10 μL da mistura de transfecção diretamente ao meio de crescimento existente nos poços.
- Depois, devolva as células à incubadora e permita que os plasmídeos se expressem por 48 h. A substituição do meio de crescimento não é necessária.
- Monitore a eficiência da transfecção por fluorescência GFP usando um microscópio de fluorescência. As células HEK293T são eficientemente transfectadas por este método e >80% das células devem expressar GFP após 48 h.
3. Medição da atividade da luciferase
NOTA: A atividade da Luciferase é avaliada usando um sistema comercialmente disponível que ensaia a luciferase Firefly e Renilla (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Aspirar cuidadosamente o meio de cultura a partir de células HEK293T transfectadas e, em seguida, lavar as células com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS). Aspirar o PBS e lisar as células adicionando 25 μL de tampão de lise não desnaturante e incubar por 15 min com balanço suave no gelo.
- Posteriormente, adicione 20 μL do lisado resultante (nenhuma centrifugação é necessária) em uma nova placa de ensaio de 96 poços contendo 100 μL de um reagente de substrato de luciferase Firefly. Misture o prato suavemente batendo.
- Carregue a placa em um leitor de placas e meça a luminescência usando um detector superior com uma altura de leitura de 1 mm e um tempo de integração de 1 s.
NOTA: O ganho do detector pode precisar ser ajustado com base na força do sinal. - Imediatamente após a leitura da luminescência da luciferase Firefly, adicione 100 μL de substrato de luciferase Renilla aos poços. Este passo simultaneamente extingue a atividade da luciferase Firefly enquanto avalia a atividade da luciferase Renilla. Misture as amostras por agitação suave da placa e meça a luminescência novamente para avaliar a atividade da luciferase de Renilla .
NOTA: Enquanto outras placas podem ser usadas para este ensaio, o uso de placas com quadros pretos e poços brancos fornecerá os resultados mais sensíveis, pois isso amplifica o sinal de luciferase, minimizando o ruído. - Quantifique as respostas do repórter como a razão Luciferase Firefly para Renilla luciferase (Firefly/Renilla) e calcule a média dos valores das medições triplicadas. Posteriormente, normalize o valor de Firefly/Renilla para cada variante em relação aos valores para células expressivas Ube3a do tipo selvagem (WT) para comparar a atividade relativa das proteínas variantes.
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Resultados
A triagem funcional em larga escala de variantes de Missense do Ube3a identifica um amplo cenário de mutações de perda e ganho de função
Trabalhos anteriores com mutantes Ube3a sugeriram que a resposta Wnt pode servir como um repórter da atividade celular da proteína UBE3A. Essas observações foram expandidas e experimentos de validação adicionais foram realizados para investigar se o ensaio BAR é adequado para relatar uma série de atividades UBE3A na célula. Primeiro, as células HEK2...
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Discussão
O protocolo aqui descrito fornece um método eficiente e escalável para avaliar a atividade enzimática das variantes de Ube3a. Existem vários detalhes técnicos que merecem uma consideração cuidadosa ao usar este ensaio. Uma consideração é a escolha dos plasmídeos repórteres Wnt utilizados neste ensaio. O protocolo descrito aqui usa especificamente o β-catenin activated reporter (BAR)21, um reportador que contém um concatenador de 12 elementos de resposta do fator de células T (TCF) separad...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), um NARSAD Young Investigator Award da Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), uma bolsa de pesquisa da Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), e bolsas de pesquisa da Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), da Whitehall Foundation (J.J.Y.) e do NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb Escada de DNA | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp Escada de DNA | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Tampão para T4 DNA Ligase com 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Tampão de reação Phusion HF | New England BioLabs | B0518S | |
| Solução Antibiótica-Antimicótica | Corning | 30004CI | |
| Isoplaca Preta/Branca-96 Moldura Preta Placa de Poço Branco | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicilina Dissódica Sal | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Invitrogen por Thermo Fisher Scientific | C10283 | ||
| Condessa II Contador de Células Automatizado | life technologies | Máquina de contagem de células | |
| Oligos de DNA personalizados | Tecnologias de DNA Integradas (IDT) | ||
| Desoxinucleotídeo (dNTP) Mistura de Soluções | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX, piruvato | Gibco | 10569044 | Meio basal para apoiar o crescimento da linha celular HEK293T |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Enzima de restrição |
| Soro bovino fetal, qualificado, inativado por calor | Gibco | 16140071 | Soro fetal bovino |
| Placas de cultura de tecidos tratadas com superfície Fisherbrand | FB012924 | ||
| FuGENE 6 Reagente de transfecção | Promega | E2691 | |
| Corante de carregamento de gel roxo (6x) | New England BioLabs | B7024A HEK293T | |
| células | ATCC | CRL-3216 | |
| Alta Eficiência ig 10B Células Quimicamente Competentes | Genômica Intacta | 1011-12 | E. coli DH10B Células |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmídeo | |||
| pGL3 BAR plasmídeo | |||
| Phusion HF DNA Polimerase | da polimerase de DNA | M0530L | da New England BioLabs |
| aplicado por tecnologias | Termociclador | ||
| pTK Plasmídeo | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini preparação |
| QIAquick Kit de Extração de Gel (250) | Qiagen | 28706 | Purificação de gel |
| Kit de Purificação de PCR QIAquick (250) | Qiagen | 28106 | PCR |
| purificação rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Enzima de restrição |
| Synergy HTX Leitor Multi-Modo | BioTek | O leitor de placas executa o software Gen5 v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetato-EDTA, Solução 50x, Eletroforese | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Placa de Cultura de Tecidos 96 poços, Fundo Plano | Fisherbrand | FB012931 | |
| Solução UltraPure Brometo de Etídio | Invitrogen da Thermo Fisher Scientific | ||
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Enzima de restrição |
Referências
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Reimpressões e permissões
