O presente protocolo descreve uma nova técnica de bandagem aórtica em camundongos para induzir hipertrofia cardíaca por sobrecarga pressórica. Para bandas, um anel de borracha com um diâmetro interno fixo é usado. Esta nova técnica promete menos variância e mais dados reprodutíveis para experimentos futuros.
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Artigo de método
Bandas Aórticas O-Ring versus Constrição Aórtica Transversa Tradicional para Modelagem da Hipertrofia Cardíaca Induzida por Sobrecarga de Pressão
Neste artigo
Resumo
Resumo
A banda aórtica em camundongos é um dos modelos experimentais mais comumente utilizados para hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de pressão cardíaca e indução de insuficiência cardíaca. A técnica utilizada anteriormente é baseada em uma sutura rosqueada ao redor do arco aórtico amarrada sobre uma agulha 27 G embotada para criar estenose. Este método depende do cirurgião apertar manualmente a rosca e, assim, leva a uma alta variância no tamanho do diâmetro. Um método recém-refinado descrito por Melleby et al. promete menor variância e mais reprodutibilidade após a cirurgia. A nova técnica, a bandagem o-ring-aórtica (ORAB), usa um anel de borracha antiderrapante em vez de uma sutura com um fio, resultando em variação reduzida na sobrecarga de pressão e fenótipos reprodutíveis de hipertrofia cardíaca. Durante a cirurgia, o o-ring é colocado entre as artérias braquiocefálica e carótida esquerda. A constrição bem-sucedida é confirmada pela ecocardiografia. Após 1 dia, a colocação correta do anel resulta em um aumento da velocidade de fluxo na aorta transversal sobre a estenose induzida pelo anel o. Após 2 semanas, a função cardíaca prejudicada é comprovada pela diminuição da fração de ejeção e aumento da espessura da parede. É importante ressaltar que, além de menor variância no tamanho do diâmetro, o ORAB está associado a menores taxas de mortalidade intra e pós-operatórias em comparação com a constrição aórtica transversa (TAC). Assim, o ORAB representa um método superior à cirurgia TAC comumente utilizada, resultando em resultados mais reprodutíveis e uma possível redução no número de animais necessários.
Introdução
Embora a hipertrofia cardíaca fisiológica possa ser observada durante o desenvolvimento, o exercício e a gravidez, a hipertrofia cardíaca patológica responde a condições de estresse hemodinâmico, como hipertensão arterial, doença cardíaca valvar ou mutações genéticas. Inicialmente, o coração passa por um remodelamento caracterizado pelo aumento do tamanho dos cardiomiócitos e espessamento das paredes ventriculares para manter a função cardíaca 1,2. Por outro lado, o remodelamento cardíaco patológico está associado a um risco aumentado de arritmia, morte súbita e alta mortalidade. Finalmente, com o tempo, resulta em dilatação ventricular, forte diminuição da função contrátil e eventual progressão para insuficiência cardíaca (IC), que está associada a altos custos de morbidade, mortalidade e sociais3. Portanto, há uma necessidade urgente de compreender o fundo molecular para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas4.
A bandagem aórtica é um modelo que imita a hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE) induzida pela sobrecarga de pressão e a insuficiência cardíaca em camundongos5. Com este método, é possível examinar in vivo os patomecanismos do remodelamento cardíaco induzido pela sobrecarga pressórica. O primeiro procedimento de bandagem aórtica em camundongos foi relatado por Rockman et al.6. A sobrecarga de pressão é induzida por uma ligadura baseada em sutura de fio ao redor da aorta (entre a artéria carótida comum braquiocefálica e esquerda). Para criar uma estenose de 0,4 mm de diâmetro, uma sutura é colocada em torno de uma agulha de 27 G e da aorta. Após a ligadura, a agulha é removida 6,7.
Mesmo que o diâmetro da agulha seja fixo, o aperto da linha é altamente dependente do cirurgião e, portanto, afeta o fenótipo induzido da hipertrofia cardíaca. Além disso, no método baseado em fio/sutura, há um grau variável de diâmetro da estenose após a cirurgia, associado a uma alta variância na mortalidade 8,9. Além disso, treinar esse método é um desafio, especialmente no que diz respeito a encontrar o nível certo e a consistência no aperto do fio. Finalmente, no início do treinamento, ocorre alta mortalidade intra e pós-operatória devido à ruptura da aorta ou outra lesão tecidual, bem como alta variação na extensão da estenose nos animais sobreviventes.
Recentemente, um procedimento otimizado de bandagem aórtica foi descrito por Melleby et al.10. Eles apresentaram o método ORAB (o-ring aortic banding) com menor variância na estenose e níveis altamente reprodutíveis de sobrecarga de pressão usando um o-ring de borracha antiderrapante com diâmetro interno fixo de 0,71 mm, 0,66 mm e 0,61 mm. Em suma, o o-ring é cortado aberto, colocado ao redor do arco ascendente e fechado novamente por fios. Outros cientistas que utilizaram esses o-rings relataram menor variabilidade na hipertrofia cardíaca induzida9. Observaram também mortalidade intra e pós-operatória, bem como melhor reprodutibilidade e menor variância no fenótipo hipertrófico induzido 9,11. O presente artigo descreve o procedimento dessa estratégia exclusiva em um protocolo passo a passo. A experiência partilhada neste relatório ajudará outros cientistas a melhorar as suas técnicas nesta área.
Para induzir hipertrofia cardíaca resultando em insuficiência cardíaca após 6 semanas, camundongos machos C57BL/6N de 12 semanas de idade são recomendados para cirurgia. Uma comparação 2 semanas após a bandagem aórtica entre as subcepas de camundongos C57BL/6N e C57BL/6J mostrou disfunção cardíaca grave e aumento da mortalidade associada em camundongos C57BL/6N. Portanto, estes são mais adequados para modelos de insuficiência cardíaca12. Camundongos machos e fêmeas de doze semanas de idade têm um tamanho ideal para a exposição da aorta e colocação do o-ring com instrumentos especiais.
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Protocolo
As experiências com animais foram realizadas sob os princípios do comité regional (Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein, número de permissão: V242-21249/2020 [38-4/20]). Os camundongos utilizados para o presente estudo foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os animais foram mantidos em condições padrão com um ciclo leve de 12 h e 12 h noturno; água e comida eram oferecidas ad libitum.
1. Cuidados com os animais
- Hospede os ratos em gaiolas especializadas com roupas de cama, material de nidificação, um esconderijo e acesso adequado a água potável e comida.
- Manter os animais sob controlo e tratamento veterinário especializado contínuo.
NOTA: Para ratos encomendados por fornecedores externos, assegure-se de 7 dias de aclimatação antes de iniciar o procedimento.
2. Preparação do o-ring
NOTA: Recomenda-se um o-ring com um diâmetro fixo de 0,4 mm para induzir hipertrofia cardíaca após 2 semanas. A extensão e a gravidade do fenótipo cardíaco induzido dependem do tamanho do diâmetro do anel o.
- Primeiro, execute um corte do o-ring (ver Tabela de Materiais) sob o microscópio usando uma tesoura ou um bisturi para permitir a colocação ao redor da aorta (Figura 1A, B).
- Perfure cada lado do anel perto do corte com uma agulha conectada com um 8-0 sutura não absorvível e puxe o fio. Corte e deixe 2-3 cm de um lado e 2 cm do outro lado para prender o o-ring ao redor da aorta na etapa final (Figura 1C, D).
- Antes da cirurgia, pegue o auxiliar de ligadura (instrumento da espécie, ver Tabela de Materiais) e puxe a extremidade do fio (que é mantida por mais tempo) de um lado do anel através do orifício da constrição (Figura 1E, F). Coloque o auxiliar de ligadura com o o-ring anexado de lado para colocação na etapa seguinte (etapa 6).
- Para a desinfecção do anel com os fios, coloque o anel em uma solução de álcool por meia hora. Depois, coloque-o sobre a celulose para secar. Mantenha o anel seco em uma banheira ou estojo fechado até o uso. Durante a cirurgia, depois de puxar o fio através do auxiliar de ligadura, coloque o anel em uma superfície limpa até o uso.
Figura 1: Realização da preparação do o-ring para ligadura . (A) Um o-ring com diâmetro fixo é cortado com tesoura ou bisturi de um lado. (B) Imagem de um o-ring. (C) Cada lado do o-ring é perfurado com um 8-0 fio de propeno. (D) O-ring perfurado com dois fios. (E) Os fios de um lado do anel do o-ring são puxados através do orifício do auxiliar de ligadura. (F) Posição final antes da colocação: os fios de um lado são colocados através do orifício do auxiliar de ligadura, enquanto os fios do outro lado são mantidos soltos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Pré-medicação dos ratos e preparação do campo operatório
- Para receber analgesia suficiente durante a cirurgia, injete o analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg, ver Tabela de Materiais) por via intraperitoneal 20 min antes de prosseguir para a cirurgia.
NOTA: Para o presente estudo, a medicação para dor foi utilizada seguindo as recomendações da Gesellschaft für Versuchstierkunde/Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). - Após pré-medicação, anestesiar o camundongo em câmara de indução com isoflurano a 2%-4% misturado com 0,5-1,0 L/min de 100% O2.
- Raspe a pele no lado esquerdo do tórax do rato sedado. Após o barbear, coloque o rato de volta na câmara cheia de isoflurano e aguarde sedação suficiente antes de entubar o animal.
NOTA: O ponto de tempo certo da sedação mostra respiração lenta, mas evita a respiração rápida. Dependendo da configuração do gás isoflurano, leva de 2 a 3 minutos para atingir o nível certo de sedação. - Ligue a almofada de aquecimento antes da cirurgia para manter a temperatura corporal do animal (37 °C). Conecte a almofada de aquecimento a uma sonda retal (consulte Tabela de materiais) para manter a temperatura corporal do mouse automaticamente.
4. Intubação dos ratos
- Preparar os instrumentos necessários (Figura 2A). Desinfete o laringoscópio antes da cirurgia, colocando-o em álcool por cerca de 1-3 minutos e, em seguida, mantendo-o para secar durante a noite.
- Estique um elástico ao redor da almofada de aquecimento para fixar o mouse com os dentes da frente na placa. Coloque o rato sedado na almofada de aquecimento em decúbito dorsal.
- Coloque o elástico sobre os dentes da frente do animal para estender o pescoço na placa.
- Focalizar uma fonte de luz na garganta para uma boa visibilidade da abertura da traqueia para a intubação endotraqueal (Figura 2B).
- Abra a boca suavemente com uma mão posicionando um auxiliar de intubação (laringoscópio artesanal, ver Tabela de Materiais) (Figura 2A[3]).
- Com a outra mão e pinça pequena, mova suavemente a língua para limpar a abertura da traqueia.
- Use esta mão também para introduzir o tubo endotraqueal na traqueia. Por outro lado, ainda segure o auxiliar de intubação. Para a intubação, utilizar uma cânula de 22 G (ver Tabela de Materiais) (Figura 2A[1]).
- Conecte a posição do tubo endotraqueal através de uma torneira de três vias a um ventilador (ver Tabela de Materiais) para que os camundongos confirmem a posição correta do tubo endotraqueal (endotraqueal).
- Monitore a ventilação correta de acordo com as instruções do fabricante (volume corrente de 200 μL e taxa de respiração entre 100-150 respirações/min) (Figura 2C).
- Confirme a profundidade anestésica suficiente por uma verificação do reflexo da pinça do dedo do pé (sem resposta reflexa).
- Gire a configuração da anestesia para isoflurano a 2% misturado com 0,5-1,0 L/min 100% O2.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia.
- Usando um cotonete, desinfete a área da cirurgia 3 vezes com uma solução desinfetante comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
Figura 2: Intubação do rato. (A) Instrumentos de intubação: (1) Utiliza-se uma cânula i.v. 22 G como tubo endotraqueal (sem mandarina); (2) Fórceps; (3) Laringoscópio artesanal (cânula deformada/achatada colada com varas de madeira e fita adesiva). (B) Realizar a intubação na almofada de aquecimento posicionada. (C) Rato entubado ligado a um ventilador. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Cirurgia e preparação para o posicionamento do anel
NOTA: Use materiais e instrumentos estéreis para evitar infecções.
- Use uma tesoura para fazer uma incisão de pele de 0,5-1 cm de comprimento no meio de uma linha entre o processo xifoide e a axila esquerda. Use pinça para separar a camada muscular das costelas subjacentes e coloque dois afastadores (5 mm de comprimento, ver Tabela de Materiais) na incisão para expor a caixa torácica.
- Para iniciar a toracotomia esquerda, realize uma pequena incisão (~1-2 mm) nos músculos intercostais entre a segunda e a terceira costela usando uma tesoura de mola micro. Abra a cavidade torácica e espalhe a incisão com pinça angular de 45°.
- Coloque três afastadores torácicos (1,0-2,5 mm de comprimento) na incisão para abrir a cavidade torácica para melhorar a visualização.
- Para expor o arco aórtico, tente levantar e separar suavemente o timo e o tecido adiposo do arco com pinça angular de ponta fina de 45°.
6. Ligadura da aorta transversal com o o-ring
- Exponha o arco aórtico com pinça angular de 45° em uma mão. Posicione, com a outra mão, o o-ring conectado com o auxiliar de ligadura através dos fios de um lado (passo 2).
- Passar os fios utilizando o auxiliar de ligadura sob o arco aórtico do lado caudal para o lado craniano da aorta transversal entre as artérias braquiocefálica e carótida comum esquerda (Figura 3A).
- Pegue ambos os fios entre o auxiliar de ligadura e o arco aórtico com o fórceps com cuidado. Retraia e remova o auxiliar de ligadura e posicione suavemente o o-ring ao redor do arco, puxando os fios de cada lado (Figura 3B).
- Após o posicionamento bem-sucedido, fixe o o-ring com os fios e um nó cirúrgico. Faça um adicional para evitar abrir o nó de cada lado (Figura 3C).
Figura 3: Realização do implante do o-ring . (A) O arco aórtico é exposto por três afastadores de 1,0-2,5 mm. Ambos os longos fios de um lado do anel são passados sob a aorta. (B) O o-ring será colocado empurrando suavemente o anel e puxando os fios. (C) O anel é o está na posição correta, e um fio craniano é amarrado com fio caudal de cada lado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
7. Sutura e recuperação pós-operatória
- Remova os três afastadores torácicos (2,5 mm de comprimento) da incisão.
- Se necessário, elimine o ar residual do tórax, enchendo-o com uma solução salina isotônica quente a 0,9%.
- Para expor a incisão torácica para sutura, pegue dois afastadores (5 mm de comprimento) novamente para segurar a pele de lado.
- Feche o tórax com duas ou três suturas não absorvíveis 6-0 (ver Tabela de Materiais) e pinch fora o fluxo de saída do ventilador por 2 s para reinflar os pulmões.
- Remova os dois afastadores e feche a pele com três a cinco suturas absorvíveis por 4-0.
- Desligue o isoflurano e monitore. Quando o animal começa a se auto-respirar, os bigodes estão se movendo, e os reflexos de beliscões do dedo do pé podem ser acionados, extubar o rato. Coloque o rato do lado esquerdo sob a lâmpada de calor em sua unidade de cuidados e observe-o até que esteja completamente acordado.
- Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente.
NOTA: Um animal que foi submetido a cirurgia deve ter sua própria unidade de cuidados (gaiola) para melhor recuperação. - Realizar o tratamento da dor com tramadol (1 mg/mL) em água potável por 7 dias e buprenorfina (0,1 mg/kg, 3x ao dia) por injeção intraperitoneal por 3 dias após a cirurgia, se necessário.
NOTA: Siga as recomendações do comitê de ética animal local para analgesia pós-operatória. - Verifique a medicação pesando as garrafas de água diariamente e observe o comportamento do animal.
8. Confirmação da constrição bem sucedida e da posição correta do anel
- Um dia após a cirurgia, verifique a estenose usando ultrassom, medindo a velocidade máxima do fluxo sobre a estenose.
- Para medições, use ecocardiografia com um sistema de ultrassom e uma sonda transdutor com uma frequência de 30 MHz (ver Tabela de Materiais).
- Conforme descrito acima, mantenha a anestesia usando uma máscara a 1,5%-2% de isoflurano com 0,5-1,0 L/min de 100% O2.
- Coloque o animal anestesiado na almofada de aquecimento em decúbito dorsal. Ligue a almofada de aquecimento a uma sonda retal para manter a temperatura corporal a 37 °C ± 1 °C e monitorize a frequência cardíaca com um ECG utilizando quatro sensores de pata de rato (ver Tabela de Materiais).
- Para uma melhor visualização, use creme de depilação.
- Um ORAB realizado com sucesso resulta em um aumento da velocidade de fluxo sobre a estenose, medida por ultrassom (~ 2.400 mm / s) (Figura 4C). Para esta medição, posicione a cabeça do transdutor paraesternalmente no lado direito do tórax para localizar o arco aórtico por imagem bidimensional (2D) ("modo B").
- Use o Doppler colorido para visualizar o fluxo sanguíneo na aorta e medir com a onda pulsada a velocidade do fluxo sanguíneo Doppler sobre a estenose.
NOTA: Camundongos operados por simulação (cirurgia de controle sem constrição) mostram uma velocidade de fluxo sanguíneo de ~600-900 mm/s. Além disso, um ORAB bem-sucedido também resulta em uma relação de fluxo de velocidade aumentada entre a carótida direita (~150 mm/s) (RC, Figura 4A) e a carótida esquerda (~300 mm/s) LC, Figura 4B) no camundongo.
- Use o Doppler colorido para visualizar o fluxo sanguíneo na aorta e medir com a onda pulsada a velocidade do fluxo sanguíneo Doppler sobre a estenose.
- Visualize a arteria carotis interna direita e esquerda por imagem bidimensional (2D) (modo B). Posicione a cabeça do transdutor horizontal nos lados esquerdo e direito do pescoço em um ângulo de 45° e use o Doppler de onda pulsada para determinar a velocidade do fluxo sanguíneo.
NOTA: Em camundongos operados por simulação, o fluxo de velocidade em ambas as artérias é semelhante.
Figura 4: Confirmação da ligadura transversal da aorta usando a medida da velocidade do Doppler da onda de pulso nas artérias carótidas . (A) Sinais representativos da velocidade do Doppler da onda pulsada da artéria carótida direita. (B) A estenose resulta em maior velocidade de fluxo na artéria carótida direita do que na esquerda. (C) A estenose induzida pela constrição resulta em uma velocidade de fluxo na aorta descendente de mais de 2.400 mm/s. Os ratos simulados mostram uma velocidade de fluxo de 600-900 mm/s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Resultados
Geralmente, a banda aórtica imita a estenose aórtica humana e induz hipertrofia cardíaca em camundongos. Um procedimento bem-sucedido é caracterizado pelo remodelamento do tecido cardíaco refletido pela hipertrofia cardíaca e redução da função cardíaca 5,6.
Diretamente 1 dia após a operação, o efeito da constrição do anel solar da aorta transversa pode ser determinado in vivo por ecocardiografia13. A in...
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Discussão
A bandagem aórtica baseada em fio/sutura tem sido usada há muitos anos para induzir hipertrofia cardíaca por sobrecarga de pressão em camundongos. É um método estabelecido para investigar os patomecanismos de remodelamento cardíaco e progressão da doença in vivo. As limitações são a variância relativamente alta no grau de estenose e, consequentemente, o remodelamento. A técnica ORAB recentemente introduzida, descrita pela primeira vez por Melleby et al.10 , otimiza o método convencional ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para L.L., N.F. e O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 x fixadores longos, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Afastadores Rombos, 5 mm de largura | 18200-11 | ||
| 2 x Fixadores Curtos, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x ponta fina 45° pinça angular | FST (ferramentas de ciência fina) | 11160-10 | |
| 3 x Retratores Rombos, 2,5 mm de largura | 18200-10 | ||
| 3 x Fios Retratores | 18200-05 | ||
| 4-0 sutura absorvível (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Usado para suturar a pele |
| 6-0 sutura (Prolene), tamanho da agulha:13 mm | ETHICON | JDP879 | Usado para suturar o músculo do peito |
| 8-0 sutura (Prolene), tamanho da agulha: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Usado para jejuar o Anel |
| Caixa de anestesia | pequeno aparelho Havard | 50-0108 | |
| Camundongos C57BL/6N | Charles River | ||
| Fluosorber Filtro de Carvão Ativado Canister | Aparelho Havard | 34-0415 | Usado para induzir e manter anestesia |
| Laringoscopia artesanal | Intubaçõesajudam | ||
| o aparelho Harvard Vaporizador anestésico | Aparelho Havard | Usado para induzir e manter anestesia | |
| Almofada de aquecimento + sonda retal (LSI Letica Scientific Instruments: Unidade de controle de temperatura HB 101/2 ) | Aparelho Panlab/ Havard | Usado para controlar e manter a temperatura corporal | |
| cânula i.v. azul 22-gauge (Vasofix Braunü le 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubação |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (solução betadina) | Schü lke | 20003960-A | Desinfecção |
| auxiliar de ligadura | FST (ferramentas de ciência fina) | 18062-12 | Usado para realizar a ligação com O-ring |
| Iluminação de Microscópio: Conjunto Schott VisiLED MC1500/S80-55 (+ controlador) | Microscópio SCHOTT | Ligth | |
| câmera (Leica IC80 HD) | Leica | Usado para campo operacional de visualização | |
| Sistemas Completos de Anestesia MiniVac para pequenos roedores | Aparelho Havard | 75-0233 | Usado para induzir e manter anestesia |
| Ventilador de Mouse MiniVent Tipo 845 | Aparelho Havard | 73-0044 | Usado para ventilação durante a cirurgia |
| Porta-agulhas | FST (ferramentas de ciência fina) | TE-10804 | |
| O-ring, borracha antiderrapante (0.0018 mm x 0.020 mm) | Produtos de Borracha Apple | Tesoura de Tesoura do Arco Aórtico | |
| FST (ferramentas de ciência fina) | 14040-09 | Usada para cortar a pele e os fios | |
| Sistema de Retração de Pequenos Animais (Kit para Animais até 200 g) | FST (ferramentas de finos componentes) | 18200-20 | |
| Placa de Base Pequena, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Mesa integrada com almofada de aquecimento + sonda retal + tripé de ECG e transdutor | Sistema de Imagem | Ecocardiografia | |
| Temgesic (Buprenorfina) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pré-medicação para dor |
| torneira de parada de três vias (azul) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grü Dor | pós-medicação nental | |
| sonda transdutor MS400 (Visual Sonics) | de Imagem FujiFilm Visual Sonics | Ecocardiografia | |
| Sistema de ultrassom com pacote cardioligy | de Imagem FujiFilm Visual Sonics | Ecocardiografia | |
| Tesoura de Mola Vannas - 2.5 mm Cutting Edge | FST (ferramentas de ciência fina) | 15000-08 | Usado para cortar o músculo intercostal do peito |
| pomada veterinária | Bepanten | Usado para evitar que os olhos sequem |
Referências
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Reimpressões e permissões
