Este estudo descreve uma técnica para estabelecer um modelo de silicose em ratos com inalação de sílica por todo o corpo em uma câmara inalatória. Os ratos com silicose poderiam mimetizar de perto o processo patológico da silicose humana de maneira fácil, econômica e com boa repetibilidade.
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Artigo de método
Estabelecendo um modelo de silicose em ratos via exposição de corpo inteiro à sílica respirável
Neste artigo
Resumo
Resumo
A principal causa de silicose é a inalação de sílica no ambiente ocupacional. Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, os modelos de roedores continuam sendo uma ferramenta essencial para o estudo da silicose humana. Para a silicose, o processo patológico clássico precisa ser induzível através da inalação de partículas de quartzo recém-geradas, o que significa induzir especificamente doença ocupacional humana. Este estudo descreveu uma técnica para estabelecer e mimetizar efetivamente o processo dinâmico patológico evolutivo da silicose. Além disso, a técnica apresentou boa repetibilidade, sem cirurgia envolvida. O sistema de exposição inalatória foi fabricado, validado e utilizado para estudos toxicológicos sobre inalação de partículas respiráveis. Os componentes críticos foram os seguintes: (1) gerador de pó SiO2 seco a granel ajustado com um controlador de fluxo de ar; (2) 0,3m3 de câmara de exposição inalatória de corpo inteiro acomodando até 3 ratos adultos; (3) um sistema de monitoramento e controle para regular a concentração de oxigênio, temperatura, umidade e pressão em tempo real; e (4) um sistema de barreira e disposição de resíduos para proteger os técnicos de laboratório e o meio ambiente. Em resumo, o presente protocolo relata a inalação por todo o corpo, e a câmara inalatória criou um modelo silicótico de rato confiável, razoável e repetível, com baixa mortalidade, menos lesões e mais proteção.
Introdução
A silicose, causada pela inalação de sílica, é a doença ocupacional mais grave na China, sendo responsável por mais de 80% do total de notificações de doenças ocupacionais a cada ano1. A etiologia da silicose é clara, podendo ser prevenida e controlada, mas não há método de tratamento efetivo disponível2. Muitos fármacos têm se mostrado eficazes em estudos básicos, mas apresentam efeitos clínicos imprecisos 3,4. Portanto, os mecanismos patológicos e fisiológicos da silicose ainda precisam ser explorados.
Muitos estudos têm utilizado a infusão única de sílica na traqueia de ratos ou camundongos para investigar a patogênese da silicose 5,6. Embora esses modelos silicóticos de roedores pudessem ser obtidos em curto espaço detempo7, esses métodos ainda apresentavam desafios, como trauma animal e alta mortalidade. Alguns estudos envolveram a instilação de sílica armazenada nos pulmões para induzir uma reação pulmonar inespecífica, mas não mencionaram nódulos silicóticos em camundongos8. Além disso, longe da silicose aguda, a exposição crônica à sílica em ambientes ocupacionais induziu inflamação pulmonar significativamente menor e elevou os níveis de marcadores antiapoptóticos, em vez de pró-apoptóticos, nos pulmões9. Portanto, um modelo animal confiável, razoável e repetível é necessário para explorar melhor a patogênese da silicose.
O presente estudo descreve um método para mimetizar o processo de doença de pacientes com silicose através da inalação de sílica através de todo o corpo, partículas liberadas pelo ar em uma câmara de inalação, que compreende um gerador de sílica liberado pelo ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de descarte de resíduos. Este método é simples, fácil de operar e imita efetivamente o processo de evolução dinâmica patológica da silicose. Além disso, vários possíveis mecanismos e a patogênese da silicose são identificados por esse método 10,11,12. Espera-se que o protocolo proposto auxilie futuras investigações no campo relacionado à pesquisa em silicose.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Ciência e Tecnologia do Norte da China (código de protocolo LX2019033 e 2019-3-3 de aprovação). Ratos Wistar machos, com 3 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Todos os ratos foram mantidos em gaiolas estáticas com aparas de madeira. Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e receberam ração e água ad libitum. Experimentos de seguimento foram conduzidos após 1 semana de alimentação adaptativa.
1. Preparo dos animais
- Na chegada, alojar todos os ratos em uma sala específica livre de patógenos (SPF).
- Dividir aleatoriamente os ratos sadios em dois grupos (n = 10): ratos controle inalando ar puro e ratos com silicose inalando sílica.
2. Preparação de sílica
CUIDADO: O pó de sílica inalado pelo corpo humano pode danificar os pulmões. Portanto, os indivíduos devem usar macacão, luvas médicas e máscaras de proteção (E95) durante as operações.
- Triturar as partículas de sílica (ver Tabela de Materiais) com uma argamassa de ágata durante 1,5 h antes de cada exposição. Isso ocorre porque o quartzo recém-fraturado produz maiores quantidades de espécies ativas de oxigênio do que o quartzo envelhecido13, e a sílica com diâmetro de 1-5 μm é a mais patogênica.
- Pesar a sílica (30 g) usando uma balança eletrônica após a moagem, colocá-la em um recipiente de vidro e assar a 180 °C por 6 h em um secador de ar de aquecimento elétrico (ver Tabela de Materiais) para eliminar patógenos da superfície das partículas de sílica.
3. Exposição à sílica nos ratos
- Conecte a injeção e os sistemas geradores disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) e coloque a sílica (30 g) no gerador. Verifique se o pipeline de conexão está normal, se o cabo de alimentação está conectado e se a fonte de alimentação está normal.
- Verifique o nível de água da torre de pulverização e o umidificador do dispositivo de tratamento de gases residuais (ver Tabela de Materiais) manualmente e adicione água se for insuficiente (não está na linha padrão).
- Adicione água da torneira à torre de pulverização do dispositivo de tratamento de gases residuais e água destilada ao umidificador (Figura 1).
- Ligue o dispositivo de descarga de gases de escape (ver Tabela de Materiais) e o interruptor da fonte de ar para confirmar se o interior do gabinete de proteção está em estado de pressão negativa.
- Confirme se a mistura de líquidos, a mistura de pó, as válvulas de controle de fluxo de gás puro e a válvula de descarga de águas residuais sob a câmara de inalação estão fechadas.
- Coloque um total de 10 ratos na câmara de inalação (ver Tabela de Materiais) e feche o compartimento de inalação e as portas do armário blindado.
- Ajuste os seguintes parâmetros experimentais no painel de instrumentos ou no computador: pressão do gabinete: -50 a -30 Pa; concentração de oxigênio: 21%; temperatura do armário: 26-30 °C; umidade: 30%-70%; taxa de entrada de poeira: 2,0-2,5 mL/min; e concentração de poeira no gabinete: 60 ± 5 mg/m3.
NOTA: Observe os dados experimentais e o estado do equipamento continuamente durante o experimento. O alarme de falha do equipamento motivou o processamento em tempo hábil.- Expor cada animal à sílica continuamente por 3 h por dia, 5 dias por semana, e permitir que os animais do grupo controle inalem ar puro.
- Após a conclusão do experimento, feche a válvula de controle de fluxo de gás misto e abra a válvula de fluxo de gás puro. Injete o gás puro continuamente na câmara de inalação.
OBS: No presente estudo, o fluxo de gás puro (7,0-7,5 m3/h) foi injetado por pelo menos 20 min até que o gás venenoso na câmara de inalação fosse completamente substituído.- Feche a válvula de fluxo de ar puro, abra a porta, retire os ratos e envie-os de volta para a sala livre de patógenos.
- Remova o rack do rato e os componentes do tubo de ramificação em sequência e coloque-os na pia para limpeza. Após o enxágue, feche a válvula de limpeza automática e abra a escotilha.
- Limpe a parede interna com um pano limpo ou ligue o gás puro para secar o tanque. Por fim, realize a desinfecção. Após limpar e desinfetar com etanol 75%, feche o portão de exaustão e, assim que possível, abra levemente a porta da cabine de inalação para evaporar a umidade, de modo que o interior da cabine de inalação permaneça seco.
- Verifique a concentração de sílica no gabinete com um amostrador atmosférico abrangente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) duas vezes por semana para garantir a estabilidade da concentração de sílica durante o experimento. Calibrar o amostrador atmosférico antes da amostragem.
- Use uma balança analítica digital de panela única para determinação gravimétrica. A concentração calculada de sílica foi de 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabela 1).
OBS: Pesar o papel filtro antes e depois da absorção da sílica. A concentração de sílica foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula12:
onde W2 = peso do papel de filtro após a amostragem, W1 = peso do papel de filtro antes da amostragem e V = volume do ar.
- Use uma balança analítica digital de panela única para determinação gravimétrica. A concentração calculada de sílica foi de 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabela 1).
4. Aquisição e fixação dos tecidos pulmonares
- Eutanásia dos ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) e lidocaína (4 mg/kg de peso corporal). Avaliar a morte pela perda dos batimentos cardíacos14.
- Ao final do experimento, fixar o pulmão inferior direito, rim, fígado, baço e osso com paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h, embutir em parafina e cortar em cortes de 5 μm 7,15.
5. Coloração para hematoxilina e eosina (H&E)
- Desparafinizar as seções de parafina em xilol (ver Tabela de Materiais) duas vezes por 10 min a cada16 e reidratar em etanol 100%, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada por 3 min cada.
- Manchar os cortes com hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e, em seguida, lavar os cortes com água10.
- Coloque as secções em álcool clorídrico a 2% e depois em água destilada até que a cor mude para azul.
- Manchar os cortes com eosina por 1 min, desidratá-los com etanol 95%, torná-los transparentes com xileno, selá-los com goma neutra e observar ao microscópio de luz12.
6. Coloração imuno-histoquímica
- Lave rotineiramente as seções de parafina com água.
- Expor os antígenos a alta pressão (60 kPa) e alta temperatura (100 °C) por 80 s e, em seguida, bloquear com bloqueador da peroxidase endógena (3%) por 15 min para eliminar as peroxidases endógenas7.
- Incubar as amostras com anticorpos dirigidos contra CD68 (diluição 1:200 - adicionar 4 μL de CD68 a 396 μL de diluente de anticorpos; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Incubar as amostras com um anticorpo secundário (polímero IgG de cabra anti-rato conjugado com HRP; ver Tabela de Materiais) a 37 °C durante 30 minutos e, em seguida, lavar as amostras com 1x PBS.
- Visualize a imunorreatividade com 3,3-diaminobenzidina (DAB; ver Tabela de Materiais). Após a aplicação de DAB no tecido, observar a coloração do tecido ao microscópio de luz10.
OBS: O tempo de coloração variou de poucos segundos a poucos minutos de acordo com o tempo de coloração do tecido. O procedimento de coloração foi abortado colocando-se os cortes em água. Neste estudo, a coloração marrom do tecido representou a expressão positiva de CD68. Todos os anticorpos foram diluídos em 1x PBS.
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Resultados
Usando o método proposto, alguns mecanismos potenciais e a patogênese da silicose foram explorados em ratos. O esquema da câmara inalatória é mostrado na Figura 1. A câmara consistia de um gerador de sílica liberado a ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de disposição de resíduos, conforme descrito anteriormente17. As funções pulmonares, os níveis de fatores inflamatórios no soro e pulmão, a deposição de colágeno e a diferenciação miofibroblástica foram relata...
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Discussão
Como principal causa de silicose, a sílica desempenha um papel decisivo na moldagem. As partículas de sílica inaladas por pacientes com pneumoconiose são partículas frescas e livres de sílica produzidas por corte mecânico. A sílica pode gerar espécies reativas de oxigênio diretamente na superfície das partículas recém-clivadas ou indiretamente através de seu efeito sobre os macrófagos25. Portanto, a moagem de partículas de sílica é de grande importância. No protocolo proposto, a sílica foi tritura...
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82003406), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Hebei (H2022209073) e pelo Projeto de Ciência e Tecnologia do Departamento de Educação de Hebei (ZD2022127).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Detector de ar (amostrador atmosférico compressivo) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Mesa | Nenhuma marca específica é recomendada. | ||
| Anticorpo de CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Secador de sopro de ar de aquecimento elétrico | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Balança eletrônica | OHRUS | ||
| Máquina de incorporação | leica | ||
| Dispositivo de descarga de gases de escape | ESPERANÇA Indústria e Comércio Co. Ltd. | ||
| Sistemas geradores | ESPERANÇA Indústria e Comércio Co. Ltd. | ||
| Luvas (luvas finas de laboratório) | A hematoxilina médica | ||
| e eosina | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 aparelho de controle de exposição | HOPE Industry and Trade Co., Ltd. | ||
| Câmara de inalação | ESPERANÇA Indústria e Comércio Co. Ltd. | ||
| Seringa | Nenhuma marca específica é recomendada. | ||
| Microscópio de luz | olympus | ||
| Objeto slide | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-conjugado cabra anti-rato IgG polímero) | Pequim Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd | s5631 | |
| Dióxido de silício | Sigma-Aldrich | ||
| Máquina de corte | leica | RM2255 | |
| Dispositivo de tratamento de gases residuais | HOPE Industry and Trade Co., Ltd. | ||
| de produtos de plástico cooperativo | caixa úmida | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
Referências
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Reimpressões e permissões
