A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.
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Artigo de método
Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os exsudatos radiculares são os principais meios de comunicação de informação e transferência de energia entre as raízes das plantas e o ambiente circundante. A alteração na secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo visa introduzir diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) na produção de metabólitos. Primeiro, mudas de alfafa são cultivadas sob estresse de DEHP em um experimento de cultivo hidropônico. Em segundo lugar, as plantas são transferidas para tubos de centrífuga contendo 50 mL de água ultrapura esterilizada por 6 h para coletar exsudatos radiculares. As soluções são então liofilizadas em um liofilizador a vácuo. As amostras congeladas são extraídas e derivatizadas com o reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, os extratos derivatizados são medidos usando um sistema de cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas por tempo de voo (GC-TOF-MS). Os dados de metabólitos adquiridos são então analisados com base em métodos de bioinformática. Metabólitos diferenciais e vias metabólicas significativamente alteradas devem ser profundamente explorados para revelar o impacto do DEHP na alfafa em vista dos exsudatos radiculares.
Introdução
O ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) é um composto químico sintético que é amplamente utilizado em vários plásticos e polímeros como plastificante para melhorar sua plasticidade e resistência. Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem sugerido que o DEHP é um disruptor endócrino e tem efeito adverso sobre os sistemas respiratório, nervoso e reprodutivo de humanos e outros animais 1,2,3. Considerando seu risco à saúde, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, a União Europeia e o Centro de Monitoramento Ambiental da China classificaram o DEHP na lista de p....
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Protocolo
O objetivo deste protocolo é fornecer um pipeline geral, desde um experimento de cultura hidropônica até a análise metabolômica, quantificando o efeito do DEHP sobre exsudatos radiculares de alfafa.
1. Experimento de cultura hidropônica
OBS: Este protocolo apresenta um exemplo de experimento de cultivo hidropônico de alfafa para obtenção de mudas de alfafa (Medicago sativa) sob estresse de diferentes concentrações de DEHP. Foram instituídos três tratamentos: testemunha sem adição e solução nutritiva fortificada com 1 mg kg-1 e 10 mg kg-1 de di(DEHP. As concentrações d....
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Resultados
Neste experimento, exsudatos radiculares de alfafa foram coletados, extraídos e analisados de acordo com os métodos acima (Figura 1). Três grupos de tratamento foram montados: controle, baixa concentração de DEHP (1 mg L−1) e alta concentração de DEHP (10 mg L−1).
Um total de 778 picos foi detectado no cromatógrafo do controle, dos quais 314 metabólitos puderam ser identificados de acordo com os espectros de massa. Como mostrado na
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Discussão
Este protocolo fornece orientação geral sobre como coletar e medir os exsudatos radiculares da alfafa sob estresse DEHP, bem como analisar os dados do metaboloma. É preciso prestar muita atenção a algumas etapas críticas desse protocolo. Em experimentos de cultivo hidropônico, plântulas de alfafa foram cultivadas hidroponicamente em frascos de vidro preenchidos com soluções nutritivas com diferentes concentrações de DEHP. Os frascos de vidro devem ser protegidos da luz, cobrindo-os com papel alumínio durante todo o perío.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41877139), os Grandes Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41991335), o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFD0800204), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (No. BK20161616), o Plano "135" e o Programa de Fronteiras da Academia Chinesa de Ciências (ISSASIP1615).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adonitol | SIGMA& | ge; 99% | |
| Sementes de alfafa | Jiangsu Academia de Ciências Agrícolas (Nanjing, China) | ||
| Balança analítica | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | com 1% TMCS, v / v | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Coluna cromatográfica | Agilent | DB-5MS (30 m &vezes; 250 μ m &vezes; 0,25 μ m) | |
| Di (2-etilhexil) ftalato | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Cromatografia gasosa (GC) | Agilent | 7890A | |
| Instrumento de moagem | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Espectrômetro de massa (MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Metanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Cloridrato de metoxiaminatio | TCI | AR | |
| Tubo de microcentrífuga | Eppendorf | Eppendorf Qualidade | 1,5 mL |
| Forno | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Piridina | Adamas | HPLC | |
| R software | Software de análise estatística (enriquecimento de vias, topologia) | ||
| SIMCA16.0.2 | software de análise estatística (OPLS-DA etc) | ||
| Freezer de temperatura ultrabaixa | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrassom | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Secador a vácuo | Taicang Huamei fábrica de instrumentos bioquímicos | LNG-T98 |
Referências
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
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Reimpressões e permissões
