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Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

DOI:

10.3791/64488

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

In This Article

Summary

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Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Abstract

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A capacidade de autorrenovação e o potencial de diferenciação de múltiplas linhagens são geralmente considerados como as características definidoras das células-tronco hematopoéticas (CTH). No entanto, numerosos estudos têm sugerido que existe heterogeneidade funcional no compartimento das CTH. Análises recentes de célula única relataram clones de HSC com diferentes destinos celulares dentro do compartimento HSC, que são referidos como clones de HSC tendenciosos . Os mecanismos subjacentes aos resultados heterogêneos ou pouco reprodutíveis são pouco compreendidos, especialmente em relação ao tempo de auto-renovação quando frações purificadas de HSC são transplantadas por imunomarcação convencional. Portanto, estabelecer um método de isolamento reprodutível para HSCs de longa duração (CT-HSCs) e de curta duração (HSCs-ST), definido pelo tempo de sua auto-renovação, é crucial para superar essa questão. Usando triagem multi-etapa imparcial, identificamos um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de LT-HSCs no sistema hematopoiético de camundongos. Com base nesse achado, estabelecemos uma linhagem de camundongos repórteres Hoxb5 e isolamos com sucesso LT-HSCs e ST-HSCs. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5 . Este método de isolamento ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de auto-renovação e as bases biológicas para tal heterogeneidade no compartimento HSC.

Introduction

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As células-tronco hematopoéticas (CTH), que possuem capacidade de autorrenovação e multipotência, residem no ápice da hierarquia hematopoética 1,2. Em 1988, Weissman e colaboradores demonstraram pela primeira vez que o isolamento de HSCs de camundongos poderia ser obtido usando citometria de fluxo3. Posteriormente, uma fração definida por uma combinação de marcadores de superfície celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, foi relatada como contendo todas as CTHs em camundongos 4,....

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Protocol

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Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Pré-condicionamento dos camundongos receptores

  1. Preparar camundongos machos C57BL/6 congênicos com idade entre 8-10 semanas de idade como camundongos receptores. O número de camundongos receptores depende do protocolo experimental. Normalmente, preparamos de 10 a 20 camundongos para cada condição.
    1. Alimentar os camundongos com água esterilizada suplementada com enrofloxacina (170 mg/L). Como os camundongos receptores irradiados são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas o mais limp....

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Results

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Anteriormente, a capacidade de auto-renovação foi medida por meio de ensaios competitivos de transplante, nos quais acredita-se que as CTHs do doador retenham sua capacidade de auto-renovação apenas se forem observadas células de doadores de várias linhagens no sangue periférico do receptor17. Além disso, vários relatos definem LT-HSCs como células que continuam a produzir células do sangue periférico vários meses após o segundo transplante de medula óssea10,18

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Discussion

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Tradicionalmente, as CTHs definidas por marcadores de superfície celular têm sido preparadas para estudar as funções das CTHs, como a capacidade de autorrenovação e a multipotência19,20,21. Entretanto, a fração HSC imunofenotipicamente definida (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contém duas populações discretas de HSC: LT-HSCs e ST-HSCs 9,10.......

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse associados a este estudo.

Acknowledgements

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Agradecemos a Hiroshi Kiyonari pelo cuidado com os animais e por fornecer camundongos receptores na RIKEN BDR, bem como Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi pela gestão do laboratório na Universidade de Kobe. Os autores também apreciam muito o apoio contínuo a este trabalho. Masanori Miyanishi foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, e AMED-PRIME, AMED sob o número de concessão JP18gm....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL Tira de 8 Tubos, Tampa de CúpulaSSIbio3230-00
0.5M EDTA pH 8.0IinvtrogenAM9260G
100 µ Filtro de Células MFalcon352360
Seringa de insulina 30GBD326668
40 µ m Cell StrainerFalcon352340
Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL, com Tampa de Pressão do Filtro de CélulaFALCON352235
Solução de Coloração de Viabilidade 7-AADBioLegend420404
96 poços U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspirador com armadilha frascoBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotina (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6. Camundongos congênitos CD45.1Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II sistema de encomenda especial BDN/A
Tampão de coloração brilhanteBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotina (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotina (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 camundongos congênitosN/AN/ACriados em nosso laboratório
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotina (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotina (53-6.7)BioLegend100704
Tubo Centrífugo 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Tubo de Centrífuga 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) sem Ca e Mg, líquido Nacalai14249-24
Soro Fetal BovinoThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo versão 10BD Biosciences 
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotina (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mCherry (C57BL/6J background) N/AN/ACriado em nosso Laboratório
IgG a partir de soro de rato, grau técnico, >=80% (SDS-PAGE), solução aquosa tamponadaSigma-AldrichI8015-100MG
isofluranoPfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
Colunas LSMilteny biotec130-042-401
Tampão de lise BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Microplaca para Cultura de Tecidos (Para Célula de Adesão) 6WellIWAKI3810-006
Separador MidiMACSMilteny biotec130-042-302
Torta de RatoNatsume SeisakushoKN-331
Centrífuga refrigerada multiusoTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penicilina-Estreptomicina Solução Mistanacalai26253-84
Argamassa de Porcelana φ 120mm com PestleAsone6-549-03
Tubo LoBind de Proteína 1.5 mL Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Lâmina de bisturi de aço inoxidávelFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Tailveiner Restrainer para camundongos padrãoBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotina (TER-119)SeringaLuer-Slip BioLegend 116204
Terumo 5mlTERUMOSS-05LZ
Agulha Hipodérmica Terumo 23G x 1TERUMONN-2325-R
https://www.flowjo.com/solutions/flowjoGaiolas de Concêntrica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.

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Hematopoietic Stem CellsLong Term HSCsShort Term HSCsHoxb5 Reporter MiceFlow CytometryBone Marrow IsolationSelf Renewal MechanismsCell SortingLineage Negative CellsMulti Lineage Differentiation

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