Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Resumo

A replicação do DNA eucariótico é um processo altamente regulado que garante que o modelo genético de uma célula seja corretamente duplicado antes da segregação cromossômica. Como os defeitos de síntese de DNA estão subjacentes aos rearranjos cromossômicos, o monitoramento da replicação do DNA tornou-se essencial para entender a base da instabilidade do genoma. Saccharomyces cerevisiae é um modelo clássico para estudar a regulação do ciclo celular, mas os principais parâmetros de replicação do DNA, como a fração de células na fase S ou a duração da fase S, ainda são difíceis de determinar. Este protocolo utiliza pulsos curtos e não tóxicos de 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um análogo da timidina, em células de levedura TK-hENT1 modificadas, seguidas de sua detecção por reação Click para permitir a visualização e quantificação da replicação do DNA com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo. Este método pode identificar defeitos anteriormente negligenciados na fase S e na progressão do ciclo celular de mutantes de levedura, permitindo assim a caracterização de novos players essenciais para garantir a estabilidade do genoma.

Introdução

A estabilidade do genoma através da divisão mitótica é assegurada pela transmissão de um conjunto completo e igual de cromossomos para as duas progênies celulares produzidas. Isso depende da conclusão precisa de uma série de eventos que ocorrem em um determinado tempo em cada fase do ciclo celular. No G 1, as origens de replicação são licenciadas mediante o recrutamento de vários fatores de licenciamento, incluindo o Cdc6₁. Na fase S, a duplicação do genoma inteiro é iniciada a partir de múltiplas origens de replicação ativas e executada por máquinas de replicação que se reúnem em focos microscopicamente visíveis chamados fábricas de....

Protocolo

1. Cultura de células de S. cerevisiae

NOTA: As estirpes de levedura utilizadas estão listadas no quadro 1

NOTA: A duração da fase S pode ser monitorada de diferentes maneiras. Dependendo da questão a ser abordada, as células podem ser cultivadas de forma assíncrona ou síncrona após a parada do G₁ .

1. De células de S. cerevisiae de crescimento assíncrono
   NOTA: Este método permite a determinação da percentagem de células na fase S numa população de células em crescimento assíncrono. Ao determinar o tempo de duplicação, a duração da fase S (e....

Resultados

Para determinar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração de G 1 e G₂ + M (etapa do protocolo 1.1), células selvagens do tipo S. cerevisiae W303 (WT, Tabela 1) foram cultivadas de forma assíncrona em meio SC por 7 h. A cada hora, a concentração celular foi monitorada para determinar o tempo de duplicação (Figura 2B). Nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação calculado foi de 120 min ± 13 min a 25 °C (Tabela 2

Discussão

A levedura é um organismo modelo primordial para estudos do ciclo celular, mas a caracterização de sua fase S tem sido dificultada por sua incapacidade de incorporar nucleosídeos exógenos, como o BrdU, que são usados como traçadores da replicação do DNA. Equipar leveduras com alta expressão de herpes simplex timidina quinase (TK) e a adição de um transportador de nucleosídeos humanos (hENT) resolveram em grande parte esse problema^15,16. O EdU é mais versátil que .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
&alfa;-fator	Genescript	RP01002
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Euromedex	04-100--812-E
Sulfato de cobre	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azida (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternativa para Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina)	Carbosynth	NE08701
Etanol absoluto	Carlo Erba reagentes	P013A10D16	ou equivalente
Ácido L-ascórbico	Sigma	A4544
Iodeto de propídio	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
EquipmentContador de
células	OLS	CASY
Citômetro de fluxo	Agilent	NovoSampler Pro
Incubadora de agitação	Infors	444-4230	ou equivalente
agitada banho	Julabo	SW22	ou equivalente
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Microscopia de campo amplo	Leica	THUNDER Imager	ou equivalente

Água