Artigo de método

Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

DOI:

10.3791/64499

⸱

3 de fevereiro de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) derivadas do tecido podem refletir o estado funcional das células-fonte e as características do espaço intersticial do tecido. O enriquecimento eficiente desses sEVs é um pré-requisito importante para o estudo de sua função biológica e uma chave para o desenvolvimento de técnicas de detecção clínica e tecnologia de carreadores terapêuticos. É difícil isolar os sEVs do tecido porque eles geralmente estão fortemente contaminados. Este estudo fornece um método para o enriquecimento rápido de sEVs de alta qualidade do tecido do cancro do fígado. O método envolve um processo de quatro etapas: incubação de enzimas digestivas (colagenase D e DNase Ι) com tecido, filtração através de filtro celular de 70 μm, ultracentrifugação diferencial e filtração através de filtro de membrana de 0,22 μm. Devido à otimização da etapa de ultracentrifugação diferencial e à adição de uma etapa de filtração, a pureza dos sEVs obtidos por este método é maior do que a obtida pela ultracentrifugação diferencial clássica. Ele fornece uma metodologia importante e dados de apoio para o estudo de sEVs derivados de tecido.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) têm aproximadamente 30 nm a 150 nm de diâmetro e são secretadas por várias células1. Eles podem se comunicar com as células do tecido e regular o microambiente local ou distante, transportando moléculas biológicas importantes, como lipídios, proteínas, DNA e RNA para vários órgãos, tecidos, células e partes intracelulares. Assim, também podem alterar o comportamento das células receptoras 2,3. O isolamento e purificação de sEVs específicos é um pré-requisito essencial para estudar seu comportamento biológico durante o desenvolvimento e curso da doença. A ultracentrifugação diferencial, considerada padrão-ouro, é comumente usada para separar os EVs dos tecidos nos quais normalmente residem4. Restos teciduais, restos celulares, grandes vesículas e corpos apoptóticos podem ser removidos por essa técnica, restando apenas os sEVs.

Demonstrou-se que a colagenase D e a DNase I não afetam as características moleculares das células ou vesículas, sendo que as propriedades de ambas as enzimas contribuem para a liberação de vesículas na matriz extracelular 5. Essas enzimas têm sido utilizadas para extrair EVs de melanoma metastático humano, tecido de câncer de cólon e tecido da mucosa colônica 5,6,7. Entretanto, a concentração e o tempo de digestão da colagenase D e DNase I nesses métodos diferem, levando a conclusões inconsistentes. Para evitar a coprecipitação de outros subtipos de sEVs, pesquisadores removeram vesículas extracelulares maiores (0,1 μm ou 0,2 μm de diâmetro) por filtração e/ou centrifugação diferencial8. Dependendo do tecido fonte, diferentes métodos de isolamento e purificação podem ser necessários 9,10.

O uso do método tradicional de ultracentrifugação diferencial para extrair sEVs do tecido hepático resulta em uma camada de substância branca na superfície do sobrenadante, sem qualquer maneira de determinar suas propriedades. Em um estudo anterior11, essa camada de substância branca afetou a pureza dos sEVs. Embora o número de partículas e a concentração de proteínas das amostras isoladas pelo método tradicional tenham sido superiores aos do método atual, o coeficiente de variação foi grande, possivelmente porque muitos poluentes podem levar a uma baixa repetibilidade dos resultados. Ou seja, usando detergente (isto é, detectando a solubilidade de partículas em Triton X-100 a 1%), verificamos que a pureza dos sEVs obtidos por esse método foi maior. Assim, usamos este método para isolar e purificar sEVs derivados de tecido de câncer colorretal para pesquisa proteômica.

Atualmente, as pesquisas sobre sEVs no câncer de fígado estão focadas principalmente no soro, plasma e sobrenadante da cultura celular12,13,14. No entanto, os EVs derivados do tecido do câncer de fígado podem refletir com mais precisão a patologia fisiológica e o microambiente circundante do câncer de fígado e efetivamente evitar a degradação e a poluição de outros EVs15,16. Com o uso de ultracentrifugação diferencial, este método pode enriquecer o rendimento e obter sEVs de alta qualidade, fornecendo uma base importante para o estudo posterior do câncer de fígado. Este método permite que o tecido do câncer de fígado seja separado por separação nítida e seja dissociado pela colagenase D e DNase I. Em seguida, os debris celulares, as grandes vesículas e os corpos apoptóticos são removidos por filtração e ultracentrifugação diferencial. Finalmente, os sEVs são isolados e purificados para estudos posteriores.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tecido de câncer de fígado humano foi coletado de pacientes diagnosticados com malignidade hepática no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Gannan. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, e a coleta de amostras de tecido humano foi aprovada pelo comitê de ética do First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

1. Preparo

  1. Coloque o agitador descorante de transferência na incubadora e ajuste a temperatura em 37 °C. Consulte a Figura 1 para todos os outros equipamentos necessários.
  2. Limpe o bisturi e a pinça pulverizando-os com álcool a 75%.
  3. Preparar a solução digestiva medindo 6 mg de colagenase D (4 mg/mL) e 24 μL de DNase Ι (80 U/mL) e adicionando-os a 1,5 mL de meio básico RPMI-1640. Misture por inversão suave até que os aditivos estejam completamente dissolvidos.
  4. Previamente umedecer filtros celulares de 70 μm e 0,22 μm com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  5. Coloque uma placa de cultura de células estéril de 100 mm na caixa de gelo para segurar os tecidos do fígado após o descongelamento.
  6. Dentro de 15 minutos após o isolamento do tecido do carcinoma hepatocelular, lave o sangue na superfície do bloco de tecido com PBS, transfira o tecido para um tubo congelado estéril e armazene-o a -80 °C até o experimento por não mais de 2 semanas.

2. Dissociação tecidual

  1. Retire a amostra de tecido do congelador de -80 °C e coloque aproximadamente 400 mg do tecido - cortado em fragmentos de 2 mm x 2 mm x 2 mm - na placa de cultura celular de 10 cm na caixa de gelo.
  2. Mover o tecido para uma placa de 6 poços com 1,5 mL da solução digestiva; em seguida, colocar a placa no agitador descolorante de transferência (20 rpm/min) para incubar por 20 min a 37 °C para dissociação completa do tecido do câncer de fígado e liberação dos sEVs.
  3. Retire a placa de 6 poços da incubadora e coloque-a na caixa de gelo. Adicionar 80 μL de inibidor de fosfatase e 200 μL de solução completa de inibidor de protease para interromper a digestão.
  4. Transfira a solução digestiva para o filtro celular de 70 μm e filtre-a lentamente para remover quaisquer grandes detritos de tecido. Recolher o filtrado e colocá-lo num tubo de centrifugação de 2 ml.

3. Ultracentrifugação diferencial

NOTA: Execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C.

  1. Centrifugar o filtrado a 500 × g durante 10 min e recolher o sobrenadante num novo tubo de centrifugação de 2 ml. A maioria dos pequenos detritos de tecido pode então ser removida.
  2. Centrifugar o sobrenadante a 3.000 × g por 20 min para remover detritos celulares. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga até que a ponta da pipeta esteja prestes a tocar a substância branca na superfície.
  3. Centrifugar o líquido restante a 3.000 × g por 3 min; Em seguida, aspirar o sobrenadante para facilitar a coleta das vesículas. Para garantir a pureza dos sEVs, certifique-se de que a substância branca não é aspirada.
  4. Centrifugar o sobrenadante coletado a 12.000 × g por 20 min e transferir 900 μL do sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 4,7 mL. Centrifugar o líquido restante a 12.000 × g por 3 min e, em seguida, coletar e misturar ambos os sobrenadantes no mesmo tubo de ultracentrífuga. Encha o tubo completamente com PBS.
  5. Centrifugar os sobrenadantes a 100.000 × g por 60 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet enchendo o tubo ultracentrífugo com PBS e centrifugando novamente a 100.000 × g por 60 min. Ressuspender o pellet com 50 μL de PBS.
  6. Aspirar a suspensão de sEV usando uma seringa estéril de 1 mL e filtrá-la através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 600 μL e armazená-lo a -80 °C para análise posterior.

4. Avaliação da qualidade do enriquecimento

  1. Observar a morfologia dos sEVs sob microscópio eletrônico de transmissão.
    1. Em seguida, solte 10 μL da amostra de sEV em uma rede de cobre, incube à temperatura ambiente por 10 min e limpe-a com água destilada estéril, usando papel absorvente para remover o excesso de líquido.
    2. Lançar 10 μL de acetato de uranila a 2% sobre a rede de cobre para coloração negativa por 1 min. Use papel de filtro para absorver o líquido na superfície da rede de cobre e seque-o por 2 minutos sob uma lâmpada incandescente.
    3. Observe a tela de cobre sob microscópio eletrônico de transmissão e imagem a 80 kV.
  2. Use um citômetro de fluxo de nanopartículas para determinar a distribuição de tamanho e pureza dos sEVs.
    1. Antes da máquina ser ligada, prepare tubos contendo 200 μL de controle de qualidade, 200 μL de nanoesferas de sílica, 2 x 200 μL de água ultrapura, 2 x 200 μL de solução de limpeza e 200 μL de PBS.
      NOTA: Antes de testar as amostras de sEV, é necessário realizar o controle de qualidade no instrumento e testar o padrão de tamanho de partícula (a distribuição de tamanho deve ser calculada usando curvas padrão geradas com várias nanomicroesferas de diâmetros diferentes [68-155 nm] sob a mesma condição de detecção). Esferas de QC e nanoesferas de sílica foram diluídas 100x com água ultrapura em um volume total de 200 μL.
    2. Verificar o volume da solução de limpeza (>10 mL) e observar a diferença entre os níveis do líquido da bainha e do líquido residual (20-30 cm).
    3. Desligue a fonte de alimentação principal do instrumento; Após 20 s, ligue o computador e aguarde os sinais sonoros indicando que o instrumento está conectado corretamente para executar o software.
    4. Clique em Iniciar para ligar a câmera, o laser e a bomba de ar.
    5. Clique em Bainha Flow-Start Up e coloque água ultrapura na plataforma de carregamento. Após 4 min (contagem regressiva do instrumento), clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga.
    6. Após 30 s, coloque o tubo em branco na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga. Em seguida, coloque o tubo que segura a água ultrapura na plataforma de carregamento e, simultaneamente, clique em Sample-Boost | Bainha Flow-Purge.
    7. Clique em Operação Manual e coloque o tubo de concentração de partículas na plataforma de carregamento. Em seguida, clique em Sample-Boosting por 1 min e selecione simultaneamente o controle de qualidade de 250 nm Std FL SiNPs em "SAMP. Inf."
    8. Clique em Amostragem-Amostragem e ligue o detector clicando em SPCM.
      NOTA: Neste ponto, a forma de onda do sinal em tempo real pode ser vista.
    9. Clique em Auto Sampling e insira 1.0 em Sampling SET para fixar a pressão em 1 KPa. Clique na barra de ferramentas e selecione Sinal grande.
    10. Ajustar a posição horizontal do laser e ajustá-lo a 2 μm; em seguida, clique em L ou R para se certificar de que o sinal é forte e uniforme.
    11. Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
    12. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e, após 1 min, clique em Sample-Unload. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
    13. Coloque o tubo padrão de tamanho de partícula na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting por 1 min.
    14. Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.
    15. Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
    16. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e clique em Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
    17. Colocar o tubo PBS na plataforma de carga; clique em Sample-Boosting por 1 min.
    18. Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.
    19. Clique em Time to Record para coletar dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminar. Salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.
    20. Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boost e Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.
    21. Verifique as informações de amostra descritas anteriormente nas etapas 4.2.17-4.2.20; alterar o PBS (etapa 4.2.17) para a amostra de sEV e analisar os dados.
  3. Identifique ainda mais os sEVs por western blot.
    1. Determine as concentrações de proteínas dos sEVs e tecidos usando o kit de quantificação de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Calcule o volume de carga de sEVs (por exemplo, para 5 μg de proteína por poço) com base nesses resultados quantitativos. Adicione o tampão de carga na proporção de 1:4 e espalhe a mistura.
    3. Após a desnaturação em banho metálico a 100 °C (termostato seco) durante 10 minutos, separar a proteína num gel de poliacrilamida a 12% a 60 V durante 80 minutos.
    4. Transferir o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno 0,22 μm a 220 mA por 2 h usando tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%).
    5. Bloquear a membrana com 5% de leite em pó desnatado em solução salina Tween tamponada com Tris (TBST) por 1 h à temperatura ambiente e incubar com anticorpo primário (anticorpo CD9 monoclonal de coelho, anticorpo CD63 monoclonal de coelho anti-humano, anticorpo anti-humano TSG101 monoclonal de coelho, anticorpo GM130 monoclonal de camundongo anti-humano) durante a noite a 4 °C. Diluir os anticorpos primários em leite desnatado a 5% a 1:1.000.
    6. Após três lavagens com TBST, incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado à horseradish peroxidase (HRP) à temperatura ambiente por 1 h.
    7. Detectar o anticorpo ligado à HRP usando o substrato de blotting ECL e, em seguida, coletar e analisar as imagens.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os sEVs de tecidos de câncer de fígado humano têm desempenhado um papel crucial no diagnóstico, tratamento e prognóstico de pacientes com câncer de fígado. Este método usou instrumentos de laboratório comuns para isolar e purificar sEVs derivados de tecidos de câncer de fígado; isso pode fornecer suporte metodológico para o estudo de EVs. A Figura 2 ilustra o processo geral de enriquecimento de EVs de tecidos de câncer de fígado. Os sEVs nos espaços intercelulares dos tecidos são totalmente ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método repetível para extrair sEVs do tecido de câncer de fígado. Os sEVs de alta qualidade são obtidos por isolamento tecidual nítido, tratamento com enzimas digestivas, ultracentrifugação diferencial e filtração e purificação da membrana filtrante de 0,22 μm. Para a análise a jusante, é extremamente importante garantir a alta pureza dos sEVs. No processo de centrifugação diferencial, uma camada de substâncias brancas (composição desconhecida) aparecerá na superfície do sobrenadante. Como essa...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem ao Primeiro Hospital Afiliado da Gannan Medical University por apoiar este trabalho. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82260422).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m Unidade de Filtro de MembranaMillexSLGPR33RB
Seringa Estéril de 1 mLHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% Acetato de UranilaMicroscopia Ciências22400-2
4,7 mL Tubo de CentrífugaBeckman Coulter361621
Placa de corte de célula de 6 poçosLABSELECT11110
50 mL CopoTianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales CompanyCF2100800
70 µ m Filtro de célulasBiosharpBS-70-XBS
100 mm Placa de cultura de célulasCELL TERCS016-0128
600 µ L Tubo de centrífugaAxygenMCT060C
Kit de quantificação de proteína BCAThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AnticorpoAbcamab134045
CD9 AnticorpoAbcamab263019
Centrífuga 5430REppendorf5428HQ527333
Solução de limpezaNanoFCMC1801
Colagenase DRoche11088866001
Rede de cobreHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Termostato secoHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti humano CD9 AnticorpoElabscienceE-AB-F1086C
GlicinaSolarbioG8200
Anticorpo secundário de camundongo acoplado à peroxidase de rábano de cabra (HRP) ProteintechSA00001-1
Peroxidase de Rábano de Cabra (HRP) Acoplado a anticorpo secundário anti-coelho ProteintechSA00001-2
MetanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Citômetro de fluxo de nanopartículasNanoFCM INCFNAN30E20112368
Inibidores de fosfatase (PhosSTOP)Roche4906845001
Phosphate Buffered Saline (PBS)ServicebioG4202
Membrana de difluoreto de polivinilidenoSolarbioISEQ00010
Contas QCNanoFCMQS2502
RPMI-1640 meio básicoIndústrias Biológicas 
BisturiGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Nanoesferas de SílicaNanoFCMS16M-Exo
Transferência Descolorante Shaker TS-8Kylin-BellE0018
Microscópio Eletrônico de TransmissãoThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
LG01-105-4Xtecnologia de Guangzhou Lige
Proteintech28283-1-APanticorpo TSG101
C11875500BT Empresa da da pinça de do

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
  3. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  4. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  5. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  6. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  7. Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).
  8. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
  9. Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
  10. Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
  11. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  12. Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
  13. Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).
  15. Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
  16. Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Enriquecimento de Ves culasUltracentrifuga o DiferencialFiltra o de MembranaDigest o Enzim ticaCitometria de FluxoMicroscopia Eletr nica de Transmiss oMarcadores ProteicosWestern Blot

Artigos relacionados