Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Resumo

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Resumo

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam a maior superfamília de receptores e são os alvos de inúmeras drogas humanas. A triagem de alto rendimento (HTS) de bibliotecas aleatórias de pequenas moléculas contra GPCRs é usada pela indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos específicos do alvo. Neste estudo, um HTS foi empregado para identificar novos ligantes de moléculas pequenas de neuropeptídeos específicos de invertebrados GPCRs como sondas para estudos fisiológicos de vetores de patógenos humanos e veterinários mortais.

O receptor de cinina específico para invertebrados foi escolhido como alvo porque regula muitos processos fisiológicos importantes em invertebrados, incluindo diurese, alimentação e digestão. Além disso, a farmacologia de muitos GPCRs de invertebrados é mal caracterizada ou não é caracterizada; portanto, a farmacologia diferencial desses grupos de receptores em relação aos GPCRs relacionados em outros metazoários, especialmente humanos, acrescenta conhecimento às relações estrutura-atividade dos GPCRs como uma superfamília. Um ensaio HTS foi desenvolvido para células em placas de 384 poços para a descoberta de ligantes do receptor de cinina do carrapato da febre do gado, ou carrapato do gado do sul, Rhipicephalus microplus. O receptor de cinina do carrapato foi expresso de forma estável em células CHO-K1.

O receptor de cinina, quando ativado por neuropeptídeos endógenos de cinina ou outros agonistas de moléculas pequenas, desencadeia a liberação de Ca²⁺ das reservas de cálcio no citoplasma. Este ensaio de fluorescência de cálcio combinado com uma abordagem de "adição dupla" pode detectar moléculas de "impacto" de agonistas funcionais e antagonistas na mesma placa de ensaio. Cada ensaio foi conduzido usando placas de drogas carregando uma matriz de 320 pequenas moléculas aleatórias. Um fator Z confiável de 0,7 foi obtido, e três moléculas de ataque agonista e dois antagonistas foram identificados quando o HTS estava em uma concentração final de 2 μM. O ensaio de fluorescência de cálcio relatado aqui pode ser adaptado para rastrear outros GPCRs que ativam a cascata de sinalização Ca² +.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que estão presentes desde a levedura até os seres humanos, representam a maior superfamília de receptores em muitos organismos¹. Eles desempenham papéis críticos na regulação de quase todos os processos biológicos em animais. Existem 50-200 GPCRs no genoma dos artrópodes, o que significa que eles representam a maior superfamília de receptores de membrana². Eles são classificados em seis classes principais, A-F, com base em sua similaridade de sequência e funções³. Os GPCRs transduziram vários sinais extracelulares, como os de hormônios, neuropeptídeos,....

Protocolo

1. Manutenção celular

NOTA: UMA LINHAGEM CELULAR CHO-K1 que expressa de forma estável o receptor de cinina de R. microplus, denominada BMLK₃, foi desenvolvida por Holmes et ^al.16. Os detalhes do desenvolvimento da linhagem celular são apresentados em outro lugar¹⁴. Todas as etapas a seguir são realizadas em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de classe II.

1. Cultivar a linhagem celular recombinante em meio seletivo (meio F-12K contendo 10% de soro fetal bovino [FBS] e 800 μg/mL de sulfato G418) para garantir a expressão do receptor al....

Resultados

Uma placa de fármaco interna (SAC2-34-6170) composta por 320 pequenas moléculas aleatórias foi utilizada para demonstrar este ensaio de HTS como exemplo. O HTS apresentou excelente qualidade do ensaio com fator Z' de 0,7 (Tabela 1). Esse fator Z' reflete a qualidade do ensaio independente dos compostos testados³⁴. Um fator Z′ de 0,5 ou superior indica uma boa faixa dinâmica de sinal de ensaio entre as RFUs dos controles positivos e os controles negativos. Ens.......

Discussão

O objetivo do HTS é identificar moléculas atingidas através da triagem de um grande número de moléculas pequenas. Portanto, os resultados deste exemplo representam apenas uma pequena parte de um experimento HTS convencional. Além disso, as moléculas atingidas identificadas precisam ser validadas em ensaios a jusante, como um ensaio dose-dependente na mesma linhagem celular recombinante e em uma linhagem celular CHO-K1 carregando apenas o vetor vazio, que pode ser realizado simultaneamente para salvar pequenas moléculas. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% tripsina-EDTA	Gibco Invitrogen	15050-065	com vermelho de fenol
0,4% azul de tripano	MilliporeSigma	T8154	líquido, tubos de microcentrífuga estéreis
1,5 mL	Thermo Fisher	AM12400	Tubos Microfuge sem RNase
Pipeta sorológica de 5 mL	Corning	29443-045	Corning Costar Stripette embalada individualmente
Pipeta sorológica de 10 mL	Corning	29443-047	Corning Costar Stripette embalada individualmente
Tubos cônicos de 15 mL	Falcon	352196	estéreis
20 µ L pontas de filtro	USA Scientifc Inc.	P1121	pipeta sorológica de barreira estéril
de 25 mL	Corning	29443-049	Corning Costar Stripette embalada individualmente
Tubos cônicos de 50 mL	Corning	430828	graduado, estéril
150 mL reservior auto-amigável	Integra Bioscience	6317	estéril, embalado individualmente para semeadura celular no dia 1
150 mL reservior auto-amigável	Integra Bioscience	6318	estéril, empilhado, para carregamento de corante no dia 2
384/ 12,5 µ L pontas de baixa retenção	Integra Bioscience	6405	filtro longo e estéril
384/ 12.5 µ Pontas L	Integra Bioscience	6404	longo, filtro estéril
placa de 384 poços	Greiner	781091	CELLSTAR, poliestireno transparente, µ Selos de
placa de alumínio	Axygen	Scientific PCR-AS-200	à base de poliéster
Embalagem de folha de alumínio	Walmart
Biosafty gabinete II	NuAire	NU-540-300
Contador de células	Nexcelom	AutoT4
lâminas de contagem de células	Nexcelom	SD-100	20 µ
Incubadora umidificada de CO2	câmara L Lâmpada	Fisher Forma Série II
	SunvaleeyTEK	RS1000B
Dimetilsulfóxido	MilliporeSigma	276855	anhydous, >99,9%
Placa de medicamento	Corning	3680
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Corning	21-031- CV	DPBS, 1x sem cálcio e magnésio
Etanol	Koptec	2000
F-12K Mistura de Nutrientes	Corning	45000-354	(Kaighn's Mod.) com L-glutamina
Soro bovino fetal	Equitech-Bio	SFBU30
Kit de ensaio de cálcio fluorescente	ENZO Lifescience	ENZ-51017	10x96
testes G418 sulfato	Gibco Invitrogen	10131-027	Antibiótico seletivo geneticina 50 mg / mL
Tampão de Hank	MilliporeSigma	55037C	HBSS modificado, com cálcio, com magnésio, sem fenol ler
tampão HEPES	Gibco Invitrogen	15630-080	1 Molar
HTS placa de armazenamento de dados	CDD vault		https://www.collaborativedrug.com/
Sistema de manuseio de líquidos	Integra Bioscience	Viaflo	384/12.5 µ
L Centrífuga de placa	Thermo Fisher	Sorvall ST8
Leitor de placas	Tecnologia BMG	Clariostar
Poli-D-lisina	MilliporeSigma	P6407
Peptídeo agonista Rhimi-K-1	Genscript	pedido personalizado	QFSPWGamida
T-75 frasco	Falcon	353136

de preto/plano de mesa Thermo