O presente trabalho descreve um novo protocolo experimental que utiliza um suporte impresso em 3D para permitir imagens de células vivas de alta resolução de globos enucleados. Através deste protocolo, a atividade de sinalização celular de cálcio no epitélio corneano ferido de globos ex vivo pode ser observada em tempo real.
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Artigo de método
Imagem de células vivas de globos ex vivo intactos usando um novo suporte impresso em 3D
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A cicatrização de feridas epiteliais da córnea é um processo migratório iniciado pela ativação de receptores purinérgicos expressos em células epiteliais. Essa ativação resulta em eventos de mobilização de cálcio que se propagam de célula para célula, que são essenciais para iniciar a motilidade celular no leito da ferida, promovendo a cicatrização eficiente da ferida. O laboratório Trinkaus-Randall desenvolveu uma metodologia para a imagem da resposta de cicatrização de feridas corneanas em globos murinos ex vivo em tempo real. Esta abordagem envolve a enucleação de um globo intacto a partir de um rato que foi sacrificado de acordo com os protocolos estabelecidos e incubação imediata do globo com um corante indicador de cálcio. Uma contramancha que mancha outras características da célula pode ser aplicada nesta fase para ajudar com a imagem e mostrar marcos celulares. O protocolo funcionou bem com vários corantes de células vivas diferentes usados para contracoloração, incluindo actina SiR para manchar actina e coloração de membrana plasmática vermelha profunda para manchar a membrana celular. Para examinar a resposta a uma ferida, o epitélio da córnea é ferido usando uma agulha de 25 G, e os globos são colocados em um suporte impresso em 3D. As dimensões do suporte impresso em 3D são calibradas para garantir a imobilização do globo durante toda a duração do experimento e podem ser modificadas para acomodar olhos de diferentes tamanhos. A imagem de células vivas da resposta da ferida é realizada continuamente em várias profundidades em todo o tecido ao longo do tempo usando microscopia confocal. Este protocolo nos permite gerar imagens de alta resolução e qualidade de publicação usando uma objetiva de ar de 20x em um microscópio confocal. Outros objetivos também podem ser usados para este protocolo. Representa uma melhora significativa na qualidade da imagem de células vivas em globos murinos ex vivo e permite a identificação de nervos e epitélio.
Introdução
Córnea
A córnea é uma estrutura clara e avascular que cobre a superfície anterior do olho que refrata a luz para permitir a visão e protege o interior do olho de danos. Como a córnea é exposta ao meio ambiente, é suscetível a danos causados por causas mecânicas (arranhões) e por infecções. Uma lesão na córnea em um paciente saudável normalmente cura dentro de 1-3 dias. No entanto, em pacientes com condições subjacentes, incluindo deficiência de células-tronco límbicas e diabetes tipo II, o processo de cicatrização de feridas na córnea pode ser bastante prolongado1. Como a córnea é altamente inervada, essas úlceras corneanas ....
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pela Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research e pelo protocolo IACUC da Universidade de Boston (201800302).
1. Projetando os suportes impressos em 3D e a barra de cobertura
- Projete os suportes impressos em 3D e a barra de tampa que contabilizem o diâmetro médio dos globos do mouse e imprima o projeto em 3D (Figura 1A, B).
- Mantenha o diâmetro da parede interna do suporte ligeiramente maior do que o diâmetro médio do globo para....
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Resultados
Esse protocolo tem sido utilizado para produzir consistentemente dados e imagens de qualidade de publicação10. As imagens obtidas representam uma melhora significativa quando comparadas às abordagens anteriores (Figura 2). Utilizando o suporte impresso em 3D, as imagens podem ser capturadas em todas as camadas da córnea, e a mobilização de cálcio em diferentes planos z pode ser observada (Figura 3). Essa abordagem tem sido utilizada para .......
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Discussão
Este protocolo descreve uma técnica de imagem de células vivas que usa um suporte impresso em 3D para estabilizar e imobilizar olhos de animais intactos. Ele é projetado para contornar várias desvantagens significativas reconhecidas com protocolos anteriores de imagem de células vivas de tecido corneano ex vivo. Este protocolo oferece muitas vantagens para a imagem de células vivas de globos intactos. Reduz significativamente o dano tecidual desnecessário que poderia interferir com a resposta de cicatrização de .......
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Divulgações
Não temos conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao NIH pelo seguinte apoio financeiro: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Também gostaríamos de agradecer ao Massachusetts Lions Eye Research Fund e ao New England Corneal Transplant Fund.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1.75 ácido polilático azul (PLA) plástico | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material para suporte |
| 35 mm Prato, No. 1.5 Lamínula, diâmetro do vidro de 14 mm, Poli-D-Lisina Revestido | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Poço para imagens. |
| Software Autodesk Fusion 360 | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software utilizado para imprimir os suportes. |
| BD 25 G 7/8 agulhas estéreis de uso único 100 agulhas/caixa | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Para feridas induzidas experimentalmente nos globos |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Contracoloração da membrana celular. Indicador de cálcio. Concentração de 1:10.000 com uma concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico |
| Cola Completa para Casa | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Para fixar o suporte ao poço de imagem |
| Impressora 3D Ender 3 Pro | Creality (Shenzen, China) | N/A | Para imprimir o suporte |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | Número da licença: GPL2 | Softwareusado para confirmar a consistência da profundidade e do diâmetro da ferida entre globos independentes usando a análise da região de interesse |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Indicador de cálcio. Concentração de 1:100 com uma concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico |
| Soro de queratinócitos sem meio | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL de extrato de hipófise bovina, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL, 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado à |
| solução salina tamponada com fosfato médio (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Usado para lavar o excesso de mancha das córneas antes da imagem do |
| microscópio Zeiss Confocal 880 com AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | Objetiva de ampliação de 20x foi usada |
Referências
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
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Reimpressões e permissões
