O presente trabalho descreve um novo protocolo experimental que utiliza um suporte impresso em 3D para permitir imagens de células vivas de alta resolução de globos enucleados. Através deste protocolo, a atividade de sinalização celular de cálcio no epitélio corneano ferido de globos ex vivo pode ser observada em tempo real.
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Artigo de método
Imagem de células vivas de globos ex vivo intactos usando um novo suporte impresso em 3D
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Resumo
Resumo
A cicatrização de feridas epiteliais da córnea é um processo migratório iniciado pela ativação de receptores purinérgicos expressos em células epiteliais. Essa ativação resulta em eventos de mobilização de cálcio que se propagam de célula para célula, que são essenciais para iniciar a motilidade celular no leito da ferida, promovendo a cicatrização eficiente da ferida. O laboratório Trinkaus-Randall desenvolveu uma metodologia para a imagem da resposta de cicatrização de feridas corneanas em globos murinos ex vivo em tempo real. Esta abordagem envolve a enucleação de um globo intacto a partir de um rato que foi sacrificado de acordo com os protocolos estabelecidos e incubação imediata do globo com um corante indicador de cálcio. Uma contramancha que mancha outras características da célula pode ser aplicada nesta fase para ajudar com a imagem e mostrar marcos celulares. O protocolo funcionou bem com vários corantes de células vivas diferentes usados para contracoloração, incluindo actina SiR para manchar actina e coloração de membrana plasmática vermelha profunda para manchar a membrana celular. Para examinar a resposta a uma ferida, o epitélio da córnea é ferido usando uma agulha de 25 G, e os globos são colocados em um suporte impresso em 3D. As dimensões do suporte impresso em 3D são calibradas para garantir a imobilização do globo durante toda a duração do experimento e podem ser modificadas para acomodar olhos de diferentes tamanhos. A imagem de células vivas da resposta da ferida é realizada continuamente em várias profundidades em todo o tecido ao longo do tempo usando microscopia confocal. Este protocolo nos permite gerar imagens de alta resolução e qualidade de publicação usando uma objetiva de ar de 20x em um microscópio confocal. Outros objetivos também podem ser usados para este protocolo. Representa uma melhora significativa na qualidade da imagem de células vivas em globos murinos ex vivo e permite a identificação de nervos e epitélio.
Introdução
Córnea
A córnea é uma estrutura clara e avascular que cobre a superfície anterior do olho que refrata a luz para permitir a visão e protege o interior do olho de danos. Como a córnea é exposta ao meio ambiente, é suscetível a danos causados por causas mecânicas (arranhões) e por infecções. Uma lesão na córnea em um paciente saudável normalmente cura dentro de 1-3 dias. No entanto, em pacientes com condições subjacentes, incluindo deficiência de células-tronco límbicas e diabetes tipo II, o processo de cicatrização de feridas na córnea pode ser bastante prolongado1. Como a córnea é altamente inervada, essas úlceras corneanas não cicatrizantes e erosões recorrentes da córnea são muito dolorosas e diminuem muito a qualidade de vida dos pacientes que as vivenciam1.
Sinalização celular
Quando uma córnea saudável é lesada, os eventos de sinalização de cálcio nas células adjacentes à ferida precedem e provocam a migração celular para o leito da ferida, onde fecham a lesão sem o risco de cicatrizes 2,3. Esses eventos de sinalização têm sido bem caracterizados em modelos de cultura de células epiteliais corneanas utilizando imagens de células vivas2. Experimentos preliminares demonstram significativamente mais sinalização de cálcio após lesão em células não diabéticas em comparação com células diabéticas. No entanto, a caracterização dos eventos de sinalização celular em globos ex vivo tem se mostrado um desafio técnico.
Imagem de células vivas
Estudos anteriores registraram com sucesso eventos de sinalização de cálcio a partir de modelos de cultura celular in vitro de cicatrização de feridas corneanas 4,5,6. O desenvolvimento de uma metodologia para produzir imagens de alta qualidade desses eventos de sinalização em tecido ex vivo é de grande interesse, pois permitiria o estudo desses eventos em um sistema mais complexo e realista. Abordagens anteriores envolveram dissecção da córnea seguida de imobilização em gel PEG induzido por UV 7,8,9. A imobilização é um passo essencial, mas desafiador, ao trabalhar com tecido vivo, pois deve permanecer viável e hidratado durante todo o curso do experimento. Além disso, a imobilização não deve danificar o tecido. Enquanto a solução de PEG imobilizou o tecido, a resolução e a qualidade das imagens produzidas não foram consistentes. Portanto, os suportes impressos em 3D foram desenvolvidos para imobilizar globos intactos para produzir imagens de maior qualidade com menos risco de danos nos tecidos.
A abordagem
Um suporte impresso em 3D exclusivo foi desenvolvido para imobilizar globos ex vivo intactos para imagens de células vivas. Este suporte evita danos de duas fontes principais: permite a imagem de um globo enucleado sem a necessidade de dissecar a córnea e elimina a exposição à luz UV. Sem essas fontes de danos, as imagens obtidas representaram com mais precisão a resposta às lesões por arranhões feitas experimentalmente. Além disso, o suporte impresso em 3D foi calibrado para as dimensões precisas do olho murino. Isso proporcionou um ajuste muito melhor do que a imobilização na solução PEG, levando a uma imagem de maior qualidade em objetivos de menor potência devido à diminuição do movimento do tecido. Uma barra de cobertura presa à parte superior do suporte garante que o globo permaneça imóvel durante toda a duração do experimento e que não haja deslocamento do globo quando o meio de crescimento é aplicado para manter a hidratação e a viabilidade. A capacidade de imprimir o suporte em dimensões precisas também nos permite gerar um ajuste ideal para olhos murinos de diferentes tamanhos devido à idade ou ao status da doença. Esta tecnologia pode ser aplicada de forma mais ampla para desenvolver suportes para os olhos de diferentes espécies com base em suas dimensões.
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pela Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research e pelo protocolo IACUC da Universidade de Boston (201800302).
1. Projetando os suportes impressos em 3D e a barra de cobertura
- Projete os suportes impressos em 3D e a barra de tampa que contabilizem o diâmetro médio dos globos do mouse e imprima o projeto em 3D (Figura 1A, B).
- Mantenha o diâmetro da parede interna do suporte ligeiramente maior do que o diâmetro médio do globo para explicar os diferentes tamanhos de ratos individuais. Mantenha a altura do suporte em cerca de metade do diâmetro do globo, garantindo um ajuste apertado do globo quando preso pela barra de cobertura impressa em 3D.
- Dimensione a barra de tampa do suporte para o comprimento do diâmetro externo do suporte com uma largura que seja de 1/4 a 1/2 do diâmetro do suporte. A barra de cobertura é dimensionada para permitir o acesso ao globo quando presa no suporte para hidratação e remoção do olho na conclusão do experimento.
- Imprima o suporte e a barra de cobertura.
2. Coleta de amostras
- Camundongos eutanasiantes (camundongos machos C57BL/6 com idades entre 9-12 semanas e 27 semanas de idade foram utilizados para este estudo) usando protocolos estabelecidos em conformidade com as diretrizes institucionais. Para este protocolo, realizar a eutanásia com dióxido de carbono seguida de decapitação.
- Remova a cabeça do rato e coloque-a imediatamente sobre o gelo para preservar a viabilidade do tecido. Enuclear os globos usando ferramentas de dissecação, evitando danos nos tecidos.
- Proponse o globo usando uma pinça. Corte o nervo óptico usando uma tesoura de dissecção logo abaixo de onde é segurado pelas pinças.
NOTA: Para precauções adicionais, execute as seguintes etapas em um exaustor de fluxo laminar. - Incubar os globos em 2 mL de meio em uma placa de cultura de células p35 incluindo um indicador de cálcio e/ou coloração da membrana celular por 1 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 com condições de pouca luz. Certifique-se de que os globos estejam submersos no meio de coloração para uma coloração uniforme.
- Para os experimentos aqui realizados, utilizar o indicador de cálcio, Fluo4-AM (1:100)2, e contracoloração da membrana celular, coloração da membrana plasmática vermelha profunda (1:10.000)2, com concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico em 2 mL de meio livre de soro de queratinócitos (KSFM) com os seguintes suplementos de crescimento: 25 μg/mL de extrato hipofisário bovino, Fator de crescimento epidérmico de 0,02 nM, CaCl2 de 0,3 mM e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL e 100 μg/mL, respectivamente).
NOTA: As condições e os tempos de incubação são variáveis dependendo do indicador de cálcio, do tipo de tecido e do volume da amostra. Ao usar ácido plurônico, recomenda-se cautela, pois torna o tecido permeável. Este protocolo exige 10% de ácido plurônico. Concentrações mais baixas de ácido plurônico foram determinadas experimentalmente como ineficazes, e concentrações mais altas correm o risco de danos ao tecido.
- Para os experimentos aqui realizados, utilizar o indicador de cálcio, Fluo4-AM (1:100)2, e contracoloração da membrana celular, coloração da membrana plasmática vermelha profunda (1:10.000)2, com concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico em 2 mL de meio livre de soro de queratinócitos (KSFM) com os seguintes suplementos de crescimento: 25 μg/mL de extrato hipofisário bovino, Fator de crescimento epidérmico de 0,02 nM, CaCl2 de 0,3 mM e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL e 100 μg/mL, respectivamente).
3. Preparação dos suportes de amostras
- Cole os suportes a uma tampa de fundo de vidro limpa com cola que não tenha sido usada anteriormente. A cola usada neste protocolo vem de recipientes de uso único para garantir a esterilidade e um novo recipiente fechado é usado todas as vezes.
- Lave o suporte em etanol a 70%. Coloque cola no suporte e cole-o à tampa do fundo de vidro. Certifique-se de que nenhuma cola esteja dentro da área interna do suporte, pois a cola pode fluorescer, complicando a imagem.
- Aguarde até que a cola solidifique. Confirme se o suporte está seguro contra a folha de cobertura.
NOTA: Placas celulares P35 com tampas de fundo de vidro foram utilizadas para os experimentos apresentados neste manuscrito. Outras lâminas e/ou placas com fundo de vidro podem ser substituídas com base nas necessidades do experimento.
4. Ferimento dos globos oculares
- Retire os globos da solução de coloração usando conta-gotas estéreis, tomando cuidado para evitar danos teciduais à região de interesse. Lave os globos por 5 minutos à temperatura ambiente usando solução salina tamponada com fosfato estéril para remover o excesso de mancha e coloque os globos no meio para transporte ao microscópio.
- Enrole os globos usando uma agulha estéril de 25 G na região de interesse.
- Usando um conta-gotas estéril, pegue e segure o globo na parte de trás do olho. Isso manterá o globo estável, impedirá que ele role e permitirá que feridas consistentes sejam feitas. Usando essa configuração, o nervo óptico estará dentro do bico conta-gotas e a córnea estará voltada para fora.
- Para uma ferida de arranhão, mova suavemente uma agulha estéril de 25 G através da córnea exposta. Para uma ferida de punção, pressione suavemente a agulha diretamente na córnea central. Certifique-se de que a ferida não perfure a córnea.
NOTA: Pule esta etapa se uma resposta da ferida ou um ambiente ferido não for necessário para o experimento. Estudos prévios mostraram que tanto as feridas de arranhões quanto as perfurações em córneas murinas feitas com esse método são consistentes tanto em diâmetro quanto em profundidade10. A confirmação das dimensões da ferida entre globos independentes foi realizada por meio de uma análise de região de interesse.
5. Colocação da amostra no suporte
- Coloque a córnea ou a região limbal sobre a tampa na área interna do suporte e estabilize usando a tampa impressa em 3D (Figura 1C-H).
- Confirme se o globo está posicionado corretamente e se o local de interesse está em contato com a tampa de vidro. Uma vez que o globo tenha sido colocado no suporte, não tente remover o globo, pois isso pode causar danos nos tecidos.
- Adere a tampa impressa em 3D ao suporte usando cola, garantindo a estabilização. Certifique-se de que a barra de cobertura esteja aderida ao suporte e não ao globo.
NOTA: A área a ser fotografada é colocada para baixo porque o protocolo é escrito para uso em um microscópio invertido. O protocolo pode ser adaptado para microscópios verticais usando suportes com um raio interno menor e a remoção da barra de cobertura. Isso resultará em menos estabilização do globo.
6. Imagem da amostra
- Ligue o microscópio e a câmara ambiental e verifique se a câmara está umidificado. Ajustar a câmara ambiental a 35 °C e 5% de CO2 durante a duração da experiência.
NOTA: Microscópios com câmaras ambientais são preferíveis para este procedimento para evitar a desidratação e manter o globo a temperaturas ideais, mas não são necessários. - Colocar a lâmina de cobertura, o suporte e o globo estabilizado no estágio do microscópio dentro da câmara ambiental e da imagem usando técnicas de imagem de células vivas9.
- Pipete meios de crescimento adicionais na tampa para evitar a desidratação e manter a viabilidade do tecido. Certifique-se de que há meio suficiente no poço para cobrir o globo no suporte. Dependendo da duração da imagem, adicione um meio fresco quando necessário durante todo o experimento.
- Comece os experimentos usando técnicas e protocolos de imagem de células vivas. Use configurações de laser de baixa potência para preservar o tecido e evitar danos nos tecidos em experimentos de longa duração. Use objetivos apropriados para longas distâncias de trabalho. Os experimentos deste manuscrito foram realizados com uma objetiva de 20x.
NOTA: O poder e ganho do laser, a duração experimental, a localização e o plano de imagem são todas variáveis, dependendo dos parâmetros experimentais. Experimentos de imagem em globos intactos variando de 1 h a 4 h de duração foram realizados com sucesso em publicações anteriores10. - Registre e salve dados no formato de arquivo preferido. O software usado pelo microscópio produz arquivos .czi para gravação de dados.
- Descarte os globos de acordo com os protocolos institucionais padrão no final do protocolo.
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Resultados
Esse protocolo tem sido utilizado para produzir consistentemente dados e imagens de qualidade de publicação10. As imagens obtidas representam uma melhora significativa quando comparadas às abordagens anteriores (Figura 2). Utilizando o suporte impresso em 3D, as imagens podem ser capturadas em todas as camadas da córnea, e a mobilização de cálcio em diferentes planos z pode ser observada (Figura 3). Essa abordagem tem sido utilizada para ...
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Discussão
Este protocolo descreve uma técnica de imagem de células vivas que usa um suporte impresso em 3D para estabilizar e imobilizar olhos de animais intactos. Ele é projetado para contornar várias desvantagens significativas reconhecidas com protocolos anteriores de imagem de células vivas de tecido corneano ex vivo. Este protocolo oferece muitas vantagens para a imagem de células vivas de globos intactos. Reduz significativamente o dano tecidual desnecessário que poderia interferir com a resposta de cicatrização de ...
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Divulgações
Não temos conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao NIH pelo seguinte apoio financeiro: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Também gostaríamos de agradecer ao Massachusetts Lions Eye Research Fund e ao New England Corneal Transplant Fund.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1.75 ácido polilático azul (PLA) plástico | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material para suporte |
| 35 mm Prato, No. 1.5 Lamínula, diâmetro do vidro de 14 mm, Poli-D-Lisina Revestido | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Poço para imagens. |
| Software Autodesk Fusion 360 | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software utilizado para imprimir os suportes. |
| BD 25 G 7/8 agulhas estéreis de uso único 100 agulhas/caixa | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Para feridas induzidas experimentalmente nos globos |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Contracoloração da membrana celular. Indicador de cálcio. Concentração de 1:10.000 com uma concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico |
| Cola Completa para Casa | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Para fixar o suporte ao poço de imagem |
| Impressora 3D Ender 3 Pro | Creality (Shenzen, China) | N/A | Para imprimir o suporte |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | Número da licença: GPL2 | Softwareusado para confirmar a consistência da profundidade e do diâmetro da ferida entre globos independentes usando a análise da região de interesse |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Indicador de cálcio. Concentração de 1:100 com uma concentração final de 1% (v/v) de DMSO e 0,1% (p/v) de ácido plurônico |
| Soro de queratinócitos sem meio | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL de extrato de hipófise bovina, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL, 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado à |
| solução salina tamponada com fosfato médio (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Usado para lavar o excesso de mancha das córneas antes da imagem do |
| microscópio Zeiss Confocal 880 com AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | Objetiva de ampliação de 20x foi usada |
Referências
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Reimpressões e permissões
