Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.
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Artigo de método
Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias
Neste artigo
Resumo
Resumo
As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.
Introdução
A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebol....
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Protocolo
1. Isolamento bruto de plastoglobule
- Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar de milho não estressado
- Adquira seis mudas de milho saudáveis com aproximadamente 3 semanas de idade e quase no estágio de crescimento V5, pesando aproximadamente 120 g.
- Corte todas as folhas na base do caule, mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo e transporte para a câmara fria.
- Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores (cerca de 5 cm x 5 cm) usando uma tesoura.
- Moer suavemente, mas completamente, metade do tecido foliar cortado em ....
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Resultados
Após a conclusão da etapa 1 do protocolo, deve-se ser capaz de ver prontamente uma quantidade considerável de material de plastoglobule/gotícula lipídica flutuando sobre (ou perto) da camada superior da almofada de sacarose (Figura 1B-C). Outras frações também poderiam ser coletadas nesta fase. Por exemplo, os tilacóides serão peletizados e podem ser ressuspensos com o meio R 0,2 para análises subsequentes. Após a centrifugação subsequente, os plastoglóbulos.......
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Discussão
Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões semelhantes, a inclus.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
A pesquisa no grupo de laboratório Lundquist é apoiada por doações da NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) para a P.K.L. Os autores agradecem à Dra. Carrie Hiser (MSU) pelo apoio no desenvolvimento do método de isolamento de plastoglobule cianobacteriano.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbato | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glicerofosfato. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Albumina de soro bovino | Proliant Biological | 68700 | |
| Quimostatina | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| Célula de pressão francesa (modelo FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptina | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Cloreto de Magnésio | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Incubadora de agitação Multitron | Infors HT | N / A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Hidróxido de Potássio | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Bioquímicos de cisteína reduzida | MP | 101444 | |
| fluoreto de sódio | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Ortovanadato de sódio | Sigma Aldrich | 450243 | |
| pirofosfato de sódio · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sacarose | Gro-Lux Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1,2 L) | VWR | 58977-227 | Liquidificador comercial |
| Zea mays | N/A | N/A |
Referências
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
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Reimpressões e permissões
