Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Resumo

Os neutrófilos funcionam como a primeira linha de defesa celular em uma resposta imune inata, empregando diversos mecanismos, como a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Este estudo analisa as alterações morfológicas e composicionais em TNEs induzidas por estímulos microbianos e químicos utilizando metodologias padronizadas in vitro para indução e caracterização da TNE com células humanas. Os procedimentos aqui descritos permitem a análise da morfologia da NET (lítica ou não lítica) e da composição (estruturas DNA-proteína e atividade enzimática), e o efeito de fatores solúveis ou contato celular sobre tais características. Além disso, as técnicas aqui descritas poderiam ser modificadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular na composição da TNE.

As técnicas aplicadas incluem a purificação de células polimorfonucleares do sangue periférico humano usando um gradiente de densidade dupla (1,079-1,098 g/mL), garantindo pureza e viabilidade ideais (≥ 95%), conforme demonstrado pela coloração de Wright, exclusão de azul de tripano e citometria de fluxo, incluindo análise FSC versus SSC e coloração 7AAD. A formação de NET é induzida com estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e químicos (acetato de miristato de phorbol, HOCl), e os TNEs são caracterizados por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para o peptídeo antimicrobiano catelicidina (LL37) e quantificação da atividade enzimática (elastase de neutrófilos, catepsina G e mieloperoxidase). As imagens são adquiridas por microscopia de fluorescência e analisadas com ImageJ.

Introdução

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares ^1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et ^al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear....

Protocolo

As amostras de sangue foram obtidas como doações de participantes clinicamente saudáveis após consentimento informado. Todos os experimentos foram realizados com a permissão do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.

NOTA: Os critérios de inclusão no estudo foram sexo e idade indistintos e clinicamente saudáveis de acordo com as respostas dos participantes a um questionário antes de uma amostra de sangue. Uma análise hematológica foi realizada para determinar a contagem de células e descartar infecções ou anemia, bem como o teste de proteína C-reat....

Resultados

Pureza e viabilidade dos neutrófilos
As fases celulares dinâmicas são visualizadas no tubo a partir da purificação do gradiente de dupla densidade. Dentro dessas camadas, a camada correspondente aos granulócitos está acima da camada de densidade de 1,079 g/mL, distinta das fases de mononucleócitos do sangue periférico (PBMCs) e eritrócitos (Figura 1A). A morfologia das células purificadas foi verificada com a coloração de Wright por meio da observação de células com núcle.......

Discussão

Uma população altamente pura de neutrófilos viáveis deve ser obtida para induzir a liberação de TNEs, uma vez que essas células têm uma vida útil ex vivo limitada de 8 h em média, um período dentro do qual todos os experimentos devem ser realizados. Para tanto, a metodologia ideal é o gradiente de dupla densidade para otimizar o tempo de purificação, isolando células não ativadas mais responsivas à estimulação exógena, em contraste com o gradiente Ficoll-Histopaque ou as técnicas de sedimentação de Dextran

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 24 poços para cultura de células	Corning	3526
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
Placa de 96 poços para cultura de células	Costar	3596	Agitador de fundo plano
	CRM Globo	CRM-OS1
Anticorpo LL37	Santa Cruz Biotecnologia	sc-166770
Sangue tubos de coleta	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFSE)	Centrífuga Sigma-Aldrich	21878
	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´ s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)	Tubos Caisson	1201022
Falcon 50 mL	CORNING	430829
Tubos de citometria de fluxo	Miltenyi Biotec		5 mL - Sem tampas
Software	FlowJo BD Biosciences		Analisar dados de citometria de fluxo
Microscópio de fluorescência	DM 2000	LEICA
Fluoroshield com DAPI	Incubadora Sigma-Aldrich	F6057
	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Citômetro de fluxo
Leitor de microplacas Fotômetro	Clarkson Laboratory - CL
Microtubos 1,5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	encaixe de fio
Minitab Software	Minitab		análise estatística
Agulhas	BD VACUTAINER	301746	Diâmetro 1,34 mm
Microscópio óptico	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solução para gradiente de densidade
Tamponado com fosfato Salino (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Tubos de cultura Pyrex	CORNING	CLS982025	N° 9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contém Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	solução de 22 mm x 75 mm
Trypan Blue 0,4%	SIGMA	T8154-100ML