O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.
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Artigo de método
Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.
Introdução
O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR1. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR 2,3,4. O indo-1, u....
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Protocolo
Os camundongos foram mantidos no campus de Medicina da Universidade do Colorado Anschutz de acordo com os protocolos da IACUC. Todos os camundongos foram eutanasiados de acordo com os padrões da AAALAC.
1. Preparação de células imunes do baço de camundongo
NOTA: Eutanásia de camundongos ingênuos com eutanásia por CO2 . Camundongos C57BL/6 comprados do Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.
- Desinfetar a pele do rato com etanol a 70% para reduzir a possibil....
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Resultados
O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amostras de linfócito.......
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Discussão
Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo 7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do Indo-1. A cito.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.
Agradecimentos
R01AI132419, - Brasil | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muito obrigado aos nossos colegas da Cytek por discussões contínuas de análise citométrica espectral completa no software Aurora e SpectroFlo. As figuras foram criadas com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas tratadas com TC de 12 poços | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL cônico | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL com tampa |
| Tubos de fluxo de poliéster de 5mL | Corning | 352052 | |
| seringa | BD | 309646 | êmbolo apenas é usado sheith é descartado |
| filtro de 70uM | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis | Buffer Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Incubadora de células | Ferramentas de | ||
| McKesson | # 487593 | Pinça de Tecido McKesson Adson 4-3/4 Polegadas de Comprimento Aço Inoxidável Não Estéril Não Trava Cabo de Polegar 1 X 2 Dentes | |
| Dissecção Tesoura | McKesson | #970135 | Tesoura Cirúrgica McKesson Argent™ Anel de Dedo de Grau Cirúrgico de 4-1/2 Polegadas Ponta Reta Afiada / Ponta Afiada |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| Lote EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | AE29165301 |
| Software FlowJo | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Corante Éster | ebioscience | 65-085-39 | Corante de Carga de Cálcio |
| ionomicina | Millipore | 407951-1mg | |
| Fantasma Vivo/Morto 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Tubos de microcentrífuga 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Anti-Mouse Purificado CD16/CD32 (Escudo FC) ( 2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Bloco |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + vermelho fenol |
| RPMI livre de fenol | Gibco | 11835030-vermelho fenol centrífuga de | |
| mesa | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebiociência | 45-5961-82 | |
| TCR&gama;/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Produto No: C06019 | Inclui Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath Marca Fisher Banho Seco |
Referências
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N.
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Reimpressões e permissões
