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Artigo de método

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

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DOI:

10.3791/64526

⸱

16 de dezembro de 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Neste artigo

Resumo

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Resumo

O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.

Introdução

O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR1. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR 2,3,4. O indo-1, um corante de cálcio ratio-métrico, é excitado pelo laser UV com pico de emissões em dois comprimentos de onda diferentes dependentes da ligação do cálcio5, e é um corante indicador comumente usado para análise por citometria de fluxo das respostas de cálcio em linfócitos vivos. Como o perfil de emissão de Indo-1 é bastante amplo, pode ser desafiador combinar a avaliação de Indo-1 com a análise simultânea de múltiplos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo passa-faixa. Essa limitação restringe o uso da análise por citometria de fluxo das respostas do cálcio a populações pré-purificadas de células T ou a populações identificadas por um conjunto limitado de moléculas de superfície celular.

Para abordar as limitações da medição das respostas de cálcio em populações heterogêneas de linfócitos primários usando citometria de fluxo passa-faixa, um protocolo foi desenvolvido para medir a fluorescência do Indo-1 usando citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite a multiplexação do Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular, aproveitando as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo. A vantagem do uso da citometria de fluxo de espectro total sobre a citometria de fluxo convencional é sua capacidade de distinguir os sinais fluorescentes de corantes altamente sobrepostos, aumentando assim o número de marcadores de superfície que podem ser avaliados simultaneamente em cada amostra. A citometria de fluxo convencional utiliza filtros passa-banda e é restrita a um fluorocromo por sistema detector6. A citometria de fluxo de espectro total coleta sinais em todo o espectro do fluorocromo usando 64 detectores em um sistema de citometria de fluxo espectral de cincolasers 7,8. Além disso, a citometria de fluxo de espectro total aproveita os detectores APD (Avalanche Photo Diode) que apresentam sensibilidade aumentada em relação aos detectores de tubo fotomultiplicador presentes nos citômetros de fluxoconvencionais8. Consequentemente, esta abordagem é ideal para populações de células heterogêneas, tais como células mononucleares do sangue periférico ou suspensões de células linfoides secundárias murinas, pois elimina a necessidade do isolamento de populações específicas de células T antes da marcação do corante de cálcio. Em vez disso, os perfis de expressão de marcadores de superfície celular e o gating por citometria de fluxo após a coleta de dados podem ser usados para avaliar as respostas de cálcio em cada população de interesse. Como mostrado neste relatório, o Indo-1 pode ser prontamente combinado com oito anticorpos conjugados ao fluorocromo, resultando em um total de 10 assinaturas espectrais únicas. Além disso, este método pode ser prontamente aplicado a misturas de células de linhagens de camundongos congenicamente distintas, permitindo a análise simultânea das respostas de cálcio em células T selvagens em comparação com aquelas de uma linhagem de camundongos direcionada a genes.

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Protocolo

Os camundongos foram mantidos no campus de Medicina da Universidade do Colorado Anschutz de acordo com os protocolos da IACUC. Todos os camundongos foram eutanasiados de acordo com os padrões da AAALAC.

1. Preparação de células imunes do baço de camundongo

NOTA: Eutanásia de camundongos ingênuos com eutanásia por CO2 . Camundongos C57BL/6 comprados do Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.

  1. Desinfetar a pele do rato com etanol a 70% para reduzir a possibilidade de entrada de contaminantes externos na amostra.
  2. Disseque o baço de camundongo usando ferramentas de dissecção, tesoura cirúrgica e pinça. Colher o baço e colocá-lo destacado em tubo cônico de 50 mL com ~5 mL de meio RPMI completo (cRPMI) sobre gelo.
    NOTA: O RMIP completo é composto por SFB a 10%, L-glutamina a 2 mM e penicilina/estreptomicina a 1%.
    1. Para colher o baço do rato, faça uma incisão de 5 cm no pelo e na pele ao longo do lado esquerdo do rato a meio caminho entre as patas dianteiras e traseiras com uma tesoura. Abra a cavidade do corpo ~5 cm e remova o baço usando pinças. O baço é da cor de um feijão e é mais longo e plano do que o rim vizinho.
  3. Deite o conteúdo do passo 1.2 num filtro estéril de 70 μm ligado a um novo tubo cónico de 50 ml. Separe mecanicamente o baço em uma suspensão de célula única, empurrando o baço através do filtro com um êmbolo de seringa de 5 mL até que nenhuma polpa de baço permaneça na superfície do filtro.
  4. Pelotar os esplenócitos utilizando uma centrífuga de bancada de rotor oscilante a 500 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Decantar cuidadosamente o sobrenadante. Os esplenócitos peletizados permanecem no fundo do tubo cônico de 50 mL.
  6. Para remover as hemácias, ressuspenda os esplenócitos peletizados em 1 mL de tampão de lise ACK por 3 minutos de acordo com as instruções do fabricante. Misture bem.
  7. Temperar o tampão de lise ACK com 15 mL de cRPMI.
  8. Pellet os linfócitos conforme indicado no passo 1.4.
  9. Ressuspender a suspensão celular em 5 mL de cRPMI em um tubo cônico de 50 mL. Coloque as amostras no gelo.
    1. Para contar as células, transfira 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL e dilua na proporção de 1:1 com solução de azul de Trypan. Em seguida, transferir para um hemocitômetro ou sistema automatizado de contagem celular.
  10. Após a contagem, dependendo da concentração celular na suspensão celular como na etapa 1.9, pastlet as células em uma centrífuga de mesa a 500 x g a 4 °C por 5 min para se preparar para a adição de meios cRMPI contendo corante éster Indo-1 AM.
  11. Calcular o volume de ressuspensão das células para atingir 10-12 x 106 células/mL. Esta é uma concentração de 2x da contagem total de células necessária.
  12. Ressuspenda as células no volume de cRPMI calculado na etapa 1.11. Colocar as células a 37 °C com CO2 a 5% num tubo cónico de 50 ml com a tampa ventilada ou numa placa de cultura de tecidos.

2. Corante ratiométrico indo-1 e marcação de anticorpos fluorescentes

  1. De acordo com as instruções do fabricante, adicione 50 μL de DMSO num frasco para injetáveis contendo 50 μg de Indo-1 AM. A concentração da solução-mãe é de 1 μg/μL.
    NOTA: DMSO é fornecido em micro-frascos com o kit para evitar qualquer oxidação de DMSO.
  2. Diluir a alíquota de reserva (1 μg/μL) no volume experimental adequado (estabelecido em 1.11) de cRPMI a uma concentração de 6 μg/ml, uma concentração de 2x. Não armazene Indo-1 em solução aquosa.
    NOTA: Outros tampões com adição de cálcio podem ser usados dependendo das necessidades celulares.
  3. Reserve o meio completo com Indo-1 em banho-maria a 37 °C.
    NOTA: Use a concentração mínima de éster Indo-1 AM necessária para obter um sinal adequado. Isso precisa ser titulado para vários tipos de células. Normalmente, uma concentração entre 3-5 μM é suficiente. Para células T primárias, células de carga com Indo-1 em uma concentração >5 μg/mL aumenta a intensidade fluorescente média (MFI) acima de um log de 6 em citômetros de fluxo espectral. Se isso ocorrer, diminua a intensidade do laser UV e titule o Indo-1 para uma concentração mais baixa.
  4. Diluir a suspensão celular previamente preparada (no passo 1.12), 1:1 em cRPMI, incluindo o meio 2x Indo-1 fabricado no passo 2.2. Certifique-se de que as células estão em uma concentração entre 5-6 x 106/mL.
    NOTA: Não core o controle de mancha única sem coloração ou os controles de célula de mancha única do marcador de superfície com Indo-1. A adição de Indo-1 a controles de anticorpos de coloração única criará uma amostra multicolorida devido ao Indo-1 adicionado a células coradas únicas. Incluir o controle adicionado de EGTA indo-1 (sem cálcio) à placa de amostra criada na etapa 2.6.
  5. Adicionar 1 mL de células/poço/condição experimental em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.
  6. Crie um único controle corado para amostra de Indo-1 (livre de cálcio) usando células previamente carregadas de corante Indo-1 e adicione EGTA a uma concentração final de 2 mM. O EGTA irá quelar o cálcio na suspensão celular, fornecendo uma amostra de controle mais limpa.
    1. Criar um controle positivo de Indo-1 (ligado ao cálcio Indo-1) adicionando 50 μM de ionomicina à suspensão celular carregada com corante no citômetro de fluxo. A ionomicina é um ionóforo de cálcio permeável à membrana que se liga aos íons cálcio e facilita a transferência de íons cálcio para dentro das células.
  7. Crie um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1.
  8. Crie um poço para controles de coloração única para quaisquer populações celulares adicionais de interesse (anticorpos definidos pelo usuário) usando fluoróforos conjugados de anticorpos em um design de painel de citometria de fluxo. Estes não incluirão o corante ratiométrico Indo-1.
  9. Adicionar o anticorpo bloqueador do receptor Fc (~2 μg/1 x 106 células), de acordo com as instruções do fabricante, antes de adicionar anticorpos adicionais conjugados ao fluorocromo para coloração de superfície.
  10. Incubar a placa durante 45 minutos a 37 °C com 5% de CO2.
  11. Ressuspenda as células em uma placa de 12 poços tocando suavemente a placa a cada 15 min.
  12. Misture e remova todo o volume de células suspensas no meio da placa de 12 poços. Em seguida, adicione a suspensão celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
  13. Pastilhar as células em microcentrífuga a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e lavar as células adicionando 1 mL de cRPMI pré-aquecido. Pelotizar novamente e decantar o sobrenadante.
    NOTA: A lavagem das células remove qualquer anticorpo bloqueador de FC restante.
  14. Ressuspender as células em 1 mL de cRPMI em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL e incubar cada tubo a 37 °C por mais 30 min a 5% de CO2, deixando a parte superior do tubo ligeiramente aberta para permitir a troca gasosa. Isso permite a desesterificação completa dos ésteres de AM intracelulares.
  15. Transfira as células de volta para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, se necessário. Anticorpos adicionais titulados conjugados ao fluorocromo definidos pelo usuário podem ser adicionados em uma fase de repouso.
    NOTA: Os marcadores usados no painel de métodos incluem: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 e tetrâmero CD1d/α-galcer. Os marcadores são escolhidos para analisar subtipos de células T.
    1. Crie uma mistura mestre de todos os anticorpos conjugados ao fluorocromo definidos pelo usuário de acordo com os tipos celulares de interesse em um volume previamente titulado em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    2. Adicionar uma mistura mestra calculada para 1 ml do volume celular, dependente de anticorpos titulados para células em repouso.
      NOTA: A vantagem da coloração na etapa 2.15 em vez da etapa posterior 2.18 é que a coloração na etapa 2.15 diminuirá o tempo total de incubação do experimento. No entanto, a coloração em um volume total de 1 mL na etapa 2.15 aumenta o uso de anticorpos.
  16. Após o repouso, pastelar as células a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
    NOTA: As células em uma placa de cultura de tecido de 12 poços podem ser peletizadas na placa com um acessório de centrífuga de placa. Caso contrário, coloque as células em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
  17. Lavar as células ressuspendendo o pellet em 1 ml de cRPMI frio a 4 °C e novamente pastilhar as células como no passo 2.16. Coloque as células no gelo.
    NOTA: Se as células de coloração de superfície separadamente, após a desesterificação na etapa 2.18, menos volume de anticorpos é necessário. A coloração superficial nesta etapa pode ser realizada após a fase de repouso em tampão de fluxo frio (1x DPBS com adição de 1% de SFB), usando anticorpos definidos pelo usuário, em gelo por 30 min. Lavar as células após a coloração em cRPMI como no passo 2.17.
    1. Adicione a mancha de viabilidade Ghost540 diluída 1:7.500 em DPBS às amostras de acordo com as instruções do fabricante. O calor mata as células a 55 °C em um bloco de aquecimento para controle de vivos/mortos com coloração única.
      NOTA: A coloração funcional do corante de viabilidade para eliminar células mortas na análise por citometria de fluxo é realizada sem FBS. FBS pode interagir com corantes de amina de acordo com as instruções do fabricante.
  18. Ressuspender amostras individuais em 500 μL de cRPMI (livre de fenol vermelho) usando um tubo de fluxo de poliestireno de 5 mL com tampa.
    NOTA: As células podem ser deixadas a 4 °C por até uma hora.
  19. Aquecer a cada tubo de 5 mL contendo células, individualmente, a 37 °C em banho de esferas por 7 min antes da análise no citômetro de fluxo, mantendo o tempo consistente entre as amostras. Use um temporizador.

3. Tubo de banho de talão: manutenção da temperatura durante a análise do fluxo de cálcio

  1. Adicione contas de banho a um pequeno banho-maria, sem adição de água; aquecer até 37 °C.
  2. Cortar cuidadosamente um tubo cônico de 50 mL ao meio, na marca de 25 mL, com lâmina de barbear; Descarte a parte superior do tubo.
  3. Encha o tubo cortado pela metade 3/4 do caminho com contas de banho.
  4. Coloque o tubo criado no passo 3.2 no banho de contas criado no passo 3.1. Leve o tubo e as contas a 37 °C.
  5. Conecte o banho de contas a uma tomada elétrica ao lado do citômetro de fluxo para manter a temperatura em preparação para a análise da amostra.
  6. Adicione um corte cônico de isopor de 50 mL para segurar um tubo para posicioná-lo no lugar enquanto funciona no citômetro de fluxo. Isso eliminará a necessidade de segurar manualmente o tubo durante a análise da curva.

4. Aquisição do influxo de cálcio por citometria de fluxo

  1. Faça login no software do citômetro de fluxo em um analisador de fluxo.
  2. Clique na guia Biblioteca para adicionar etiquetas fluorescentes Indo-1 (ligadas ao cálcio) e Indo-1 (sem cálcio). Selecione Tags fluorescentes no menu do software à esquerda. Selecione o laser UV em grupos de etiquetas fluorescentes e clique em +adicionar para adicionar um nome de etiqueta fluorescente (Indo-1 (ligado ao cálcio)/Indo-1 (sem cálcio)) à biblioteca. Escolha o comprimento de onda de excitação a laser e o comprimento de onda de emissão e, em seguida, clique em Salvar. Continue para a montagem experimental.
    NOTA: Indo-1 é excitado pelo laser UV em um comprimento de onda de 355 nm. O comprimento de onda de emissão do Indo-1 (ligado ao cálcio) é de 372 nm. O comprimento de onda de emissão do Indo-1 (isento de cálcio) é de 514 nm.
  3. Clique na aba Aquisição. Abra/crie um novo experimento e adicione as tags fluorescentes desejadas ao experimento.
  4. Crie um Grupo de Referência e um novo grupo de amostra para o experimento. Rotular as amostras e os grupos de referência conforme necessário.
  5. Na guia Aquisições , defina os eventos para registrar no máximo: 10.000.000.
  6. Ajuste o volume de parada para o volume máximo: 3.000 μL.
  7. Defina o tempo de parada para o tempo máximo: 36.000 s.
  8. Adquira controles de coloração única para anticorpos conjugados definidos incluídos no painel multicolorido.
  9. Adquira controles de coloração única para corante funcional Indo-1.
    1. Adicionar 50 μM de ionomicina ao controle positivo de Indo-1 ligado ao cálcio. Vórtice para misturar. Adicione o tubo de fluxo à porta de injeção da amostra e clique em Gravar.
    2. Adicione o controle negativo de Indo-1 sem cálcio ao citômetro de fluxo e clique em Recordar. EGTA foi adicionado na etapa 2.6.
    3. Desmisture os controles manchados clicando no botão Desmisturar .
      NOTA: Todos os controles corados individualmente de todos os anticorpos conjugados e corantes funcionais devem ser registrados antes de desmisturar as amostras. Para que o botão Desmisturar funcione, todos os controles de referência precisam ser gravados primeiro. A desmistura pode ser feita antes ou depois da coleta da amostra.
  10. Quando a desmistura estiver concluída, crie gráficos sequenciais usando a planilha não misturada. SSC-A versus FSC-A removendo detritos da amostra, SSC-A versus SSC-H para remover duplicatas. Segue-se um portão de limpeza de viabilidade e um confinamento adicional às populações de interesse. Para criar portões, clique em Plotar. Adicione um gráfico à planilha e clique duas vezes dentro do portão para criar uma população fechada a jusante. Continue até que todas as populações de interesse sejam contabilizadas.
  11. Amostras de controle quentes de coloração única (das etapas 2.6-2.9 na seção Indo-1 ratiometric dye and fluorescent antibody labeling) a 37 °C para análise sequencial. Configure o software de citometria de fluxo.
  12. Passe água DI no citômetro por 2-3 min para garantir a estabilidade fluídica do citômetro de fluxo.
  13. Configure gráficos sequenciais na planilha não misturada criando portas usando os botões Polygon, Rectangle ou Ellipse gate. Porta para incluir a população de interesse (ou seja, linfócitos usando SSC-A vs. FSC-A [discriminação tamanho/linfócitos]). Populações negativas aparecem agrupadas em torno de zero, enquanto populações positivas podem ser visualizadas pelo aumento da MFI. As populações de interesse serão definidas com base na questão biológica.
  14. Clique duas vezes dentro do portão criado e altere os parâmetros dos eixos Y e X para SSC-A versus SSC-H (discriminação singlete). Complete a definição dos parâmetros do eixo clicando com o botão esquerdo do mouse nas palavras no eixo.
  15. Crie um gráfico com SSC-A versus sinal de corante de viabilidade (parâmetros da porta de viabilidade). Portão em células vivas, que são negativas para coloração de corante de amina. As células vivas, negativas para coloração de mortos vivos, se agruparão na marca 0 nos eixos Y e X.
  16. Clique duas vezes no gráfico interno para criar um novo gráfico contendo apenas linfócitos vivos de célula única. Alterar o eixo Y para Indo-1 (cálcio ligado) (V1) e/ou Indo-1 (cálcio livre) (V7) versus o tempo no eixo X para visualização do influxo de cálcio.
  17. Coloque a amostra biológica aquecida na máquina SIT e execute as amostras a 2.500-3.000 eventos/s em meio para permitir a visualização do influxo de cálcio em populações de número limitado de células (por exemplo, iNKT).
    NOTA: Ao ressuspender as células a uma concentração de 1 x 106/mL, os eventos celulares coletados na taxa de fluxo médio devem ser iguais a 2.500-3.000 eventos/s. Diminua a vazão sob controle de aquisição clicando no menu suspenso ou dilua a amostra se a suspensão da célula tiver uma concentração aumentada. Executar as amostras a uma alta taxa de fluxo pode aumentar a propagação do sinal de um fluoróforo para outros fluoróforos no painel.
  18. Adicione o tubo seguinte ao banho de contas para aquecer a 37 °C.
  19. No Controle de Aquisição, pressione Record para registrar os dados iniciais por 30 s para obter um nível basal de sinalização de cálcio na amostra.
  20. No Controle de Aquisição, clique em Parar e remova o tubo da Porta de Injeção de Amostra (SIP).
  21. Adicionar 30 μg de anti-CD3 não conjugado diretamente no tubo de amostra para iniciar o influxo de cálcio. A concentração final por tubo é de 60 μg/mL.
    NOTA: Não há etapa de lavagem após a adição de anti-CD3.
  22. Coloque o tubo de volta no SIP da máquina o mais rápido possível e pressione Gravar no software.
  23. Registrar os dados por 7 min, observando o tempo decorrido sob os controles de aquisição no software, para observar o curso temporal do influxo de cálcio dentro das populações amostrais.
  24. Após 7 min, pressione Stop no software e adicione 1 μg/mL de ionomicina. Registrar por 30 s para obter o sinal máximo de cálcio nas células de interesse. Para limitar o transporte de ionomicina para a próxima amostra, complete duas lavagens de SIT no instrumento entre as amostras.
  25. Continue para a próxima amostra e repita o fluxo de trabalho até que todas as amostras tenham sido coletadas.
  26. Salve o experimento e clique no arquivo zip de exportação . Arquivos não misturados (.fsc) são carregados para o software de análise de citometria de fluxo externo.

5. Análise da curva de cálcio

  1. Usando um software de análise6 para citometria de fluxo, converta sinais fluorescentes Indo-1 em uma razão para medidas de cálcio por lapso de tempo. Derive parâmetros na guia ferramentas inserindo referências Indo-1 (cálcio-ligado)/Indo-1 (cálcio-livre) usando uma escala linear. Defina o mínimo para zero e o máximo de acordo com a relação de influxo de cálcio, normalmente em torno de 10. A razão máxima varia de acordo com o tipo de célula e MFI de Indo-1.
  2. Realce o parâmetro selecionado. Em ferramentas, adicione análise cinética para escolher o parâmetro clicando na guia Cinética . Defina o eixo Y como derivado.
  3. Selecione MFI (intensidade fluorescente média) na guia Cinética.
  4. Adicione o alisamento gaussiano, se desejar. Para adicionar suavização gaussiana, selecione a opção no menu suspenso de estatísticas no software de análise de fluxo. O alisamento gaussiano pode ser adicionado para suavizar a visualização da curva de influxo de cálcio da análise.
  5. Crie vários intervalos para estatísticas ao longo do curso de tempo de fluxo de cálcio para comparações biológicas dentro das amostras.
  6. Arraste os exemplos para o editor de layout e adicione as estatísticas conforme desejado. A análise estatística varia de acordo com a questão biológica. Para fins de publicação, múltiplas réplicas são analisadas usando teste t ou ANOVA.
  7. Para um momento de análise de tempo, coloque a porta em um momento específico no tempo ao longo do fluxo de cálcio. Examinar os marcadores de superfície desejados e portar sobre a população de interesse; em seguida, avaliar um dot-plot bidimensional de Indo-1 (isento de cálcio) versus Indo-1 (ligado ao cálcio) para células fechadas dentro desse momento na região temporal.

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Resultados

O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amostras de linfócito...

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Discussão

Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo 7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do Indo-1. A cito...

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Divulgações

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

R01AI132419, - Brasil | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muito obrigado aos nossos colegas da Cytek por discussões contínuas de análise citométrica espectral completa no software Aurora e SpectroFlo. As figuras foram criadas com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas tratadas com TC de 12 poçosCell Treat229111
50 mL cônicoGreiner Bio141-12-17-03Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL com tampa
Tubos de fluxo de poliéster de 5mLCorning352052
seringaBD309646êmbolo apenas é usado sheith é descartado
filtro de 70uMGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC lysisBuffer GibcoA1049201
Aurora Spectral Flowcytometerhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath BeadscoleparmerItem # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Incubadora de célulasFerramentas de
McKesson# 487593Pinça de Tecido McKesson Adson 4-3/4 Polegadas de Comprimento Aço Inoxidável Não Estéril Não Trava Cabo de Polegar 1 X 2 Dentes
Dissecção TesouraMcKesson#970135Tesoura Cirúrgica McKesson Argent™ Anel de Dedo de Grau Cirúrgico de 4-1/2 Polegadas Ponta Reta Afiada / Ponta Afiada
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
Lote EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03AE29165301
Software FlowJohttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Corante Ésterebioscience65-085-39Corante de Carga de Cálcio 
ionomicinaMillipore407951-1mg
Fantasma Vivo/Morto 540Tonbo13-0879-T100
Tubos de microcentrífuga 1.7mLLight LabsA-7001
Penicilina/Estreptomicina/L-GlutaminaGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Anti-Mouse Purificado CD16/CD32 (Escudo FC) ( 2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC Bloco
RPMIGibco1875093+ vermelho fenol
RPMI livre de fenolGibco11835030-vermelho fenol centrífuga de
mesaBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebiociência45-5961-82
TCR&gama;/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent PackProduto No: C06019Inclui Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
Waterbath Marca Fisher Banho Seco
dissecação científica formal Ferramentas de

Referências

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