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Artigo de método

Extração Contínua Dinâmica de Sangue do Coração de Rato via Técnica de Microdiálise Não Invasiva

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DOI:

10.3791/64531

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13 de setembro de 2022

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a coleta dinâmica e em tempo real de sangue de coração de ratos utilizando a técnica de microdiálise.

Resumo

A análise dinâmica dos hemocomponentes é de grande importância na compreensão das doenças cardiovasculares e suas doenças relacionadas, como infarto do miocárdio, arritmia, aterosclerose, edema pulmonar cardiogênico, embolia pulmonar e embolia cerebral. Ao mesmo tempo, é urgente romper a técnica de amostragem contínua de sangue cardíaco em ratos vivos para avaliar a eficácia da terapia de medicina étnica distinta. Neste estudo, uma sonda de microdiálise sanguínea foi implantada na veia jugular direita de ratos em um procedimento cirúrgico preciso e não invasivo. Amostras de sangue cardíaco foram então coletadas a uma taxa de 2,87 nL/min a 2,98 mL/min conectando-se a um sistema on-line de coleta de amostras de microdiálise. Ainda mais momentaneamente, as amostras de sangue adquiridas podem ser temporariamente armazenadas em recipientes de microdiálise a 4 °C. O programa on-line de coleta contínua de sangue de coração de rato baseado em microdiálise tem garantido sobremaneira a qualidade das amostras de sangue, avançando e revigorando a racionalidade científica das pesquisas sobre doenças cardiovasculares sistêmicas e avaliando a terapia etnomédica sob a perspectiva da hematologia.

Introdução

Com a aceleração do ritmo de vida e o aumento da pressão psicológica, as doenças cardiovasculares (DCV) tendem a ocorrer em jovens, pessoas de meia-idade e idosos 1,2. A morbidade e a mortalidade das DCV são elevadas, com características de início agudo, rápida progressão e longo curso da doença, o que afeta seriamente a segurança dospacientes3. A ocorrência de DCV pode estar intimamente relacionada às alterações em alguns componentes sanguíneos, como colesterol, lipídios séricos, glicemia, enzimas miocárdicas e proteína quinase K 4,5,6. A situação relevante do paciente pode ser gerenciada mais rapidamente analisando itens de exame de sangue de rotina. Assim, a qualidade das amostras de sangue determina a precisão dos resultados dos testes. No entanto, os métodos convencionais de coleta de sangue apresentam algumas desvantagens inevitáveis, que afetam seriamente os resultados experimentais, tais como grande área de trauma, pequeno volume de coleta de sangue, alta exigência para operadores, incapacidade de refletir mudanças de drogas em tempo real, pré-tratamento pesado de amostras de sangue, grande consumo de animais experimentais e falha em atender aos requisitos éticos dosanimais7,8,9 . Com os avanços contínuos na tecnologia médica, a qualidade da coleta de sangue também impôs exigências mais altas. Portanto, é urgente desenvolver uma nova tecnologia de coleta de sangue para superar as deficiências acima.

A microdiálise é uma técnica de amostragem in vivo baseada nos princípios da diálise10. Em condições de não-equilíbrio, os compostos a serem medidos são difundidos e perfundidos do tecido ao longo do gradiente de concentração para a sonda de microdiálise embebida no tecido no dialisato, que é continuamente removido juntamente com o dialisato, alcançando o objetivo de amostragem do tecido vivo11,12. Comparada aos métodos tradicionais de amostragem, a técnica de microdiálise apresenta vantagens esplêndidas nos seguintes aspectos13,14,15: rastreamento contínuo em tempo real das alterações de vários compostos no sangue; a amostragem não requer pré-processamento tedioso e pode realmente representar a concentração do composto alvo no local de amostragem; sondas podem ser implantadas em diferentes partes do corpo para investigar a absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade dos compostos alvo; a amostra adquirida não contém macromoléculas biológicas (>20 kD). Portanto, as amostras de sangue de maior qualidade garantem uma melhor interpretação das DCV e do mecanismo tratado pela medicina étnica.

Os sistemas de amostragem de microdiálise geralmente consistem em bombas de microinjeção, tubos de conexão, tanques de livre circulação de animais, sondas de microdiálise e coletores de amostras16. Como parte mais crítica do dispositivo do sistema de microdiálise, as sondas comuns de microdiálise compreendem sondas concêntricas, sondas flexíveis, sondas lineares e sonda shunt17. Dentre estas, as sondas flexíveis são sondas macias e não metálicas, utilizadas principalmente para coletar amostras de vasos sanguíneos e tecidos periféricos como coração, músculo, pele e gordura de animais acordados e em movimento livre ou anestesiados13. Quando em contato com vasos sanguíneos ou tecidos, a sonda pode ser flexivelmente dobrada, evitando assim danos irreversíveis à sonda ou ao local de amostragem. Com o desenvolvimento contínuo da tecnologia de sonda, a aplicação da tecnologia de microdiálise em vários campos também está se aprofundando. Neste trabalho, o sangue do coração de ratos foi adquirido de forma dinâmica e contínua pela tecnologia de microdiálise não invasiva através da sonda flexível projetada para coleta de sangue.

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Protocolo

O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Administrativo da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2021-11). Ratos Sprague Dawley (SD) machos livres de patógenos especificados (8-10 semanas, 260-300 g) foram criados em gaiolas de ventilação independente, mantendo o ambiente de laboratório a 22 °C e 65% de umidade relativa, e foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os ratos foram habituados à alimentação adaptativa por 1 semana com água livre e dieta durante o período.

1. Preparação experimental

  1. Montar os equipamentos envolvidos na microdiálise da coleta de sangue (vide Tabela de Materiais), conforme Figura 1.
  2. Preparar solução anticoagulante citrato dextrose (ACDs), contendo 3,50 mmol/L de citrato, 7,50 mmol/L de citrato de sódio e 13,60 mmol/L de glicose, como fluido de perfusão para coleta de sangue de microdiálise (ver Tabela de Materiais).
  3. Antes de usar, filtre as ACDs com uma unidade de filtração por membrana de 0,22 μm e remova as bolhas ultrassonicamente. Manter as DACs a 37 °C para reduzir a estimulação para ratos SD.

2. Inspeção de perviedade do sistema de tubulação de microdiálise

  1. Conecte a entrada da sonda da unidade de diálise com a agulha da seringa, o adaptador de tubulação e a tubulação fep (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: A extremidade azul da sonda de microdiálise é para o influxo de fluido, e a extremidade transparente é para a saída de fluido.
  2. Verifique a patência do sistema de tubulação de microdiálise perfundindo ACDs18 no sistema de tubulação a uma velocidade de 2 μL/min.
    NOTA: Se as ACDs fluírem do local de coleta da amostra, o sistema de microdiálise desimpedido pode ser usado para coleta adicional de sangue cardíaco. Caso contrário, a sonda de sangue deve ser verificada se há vazamentos quebrados ou se a junta tubular foi selada.

3. Implante de sonda de microdiálise

  1. Anestesiar os ratos com isoflurano a 2% em uma mistura ar-oxigênio de 0,6 L/min, prender os ratos completamente inconscientes na mesa de operação e manter a temperatura corporal em 37 °C usando um mantenedor de temperatura animal (ver Tabela de Materiais).
  2. Retire o pelo do pescoço com um barbeador elétrico e desinfete o local cirúrgico com três rodadas alternadas de betadina e álcool 70%. Injetar bupivacaína (1,5 mg/kg) no rato. Expor a veia jugular direita por dissecção romba de partes moles e fáscia perivascular através de uma incisão de 1,5 cm ao longo da linha média do pescoço.
    OBS: Todos os instrumentos e ferramentas cirúrgicas utilizados no experimento devem ser previamente esterilizados por autoclavagem. Use luvas estéreis e campos cirúrgicos. Toda a operação experimental deve ser realizada em um ambiente estéril. Siga as diretrizes de uso local de animais para o regime de anestesia e analgesia.
  3. Faça um slipknot destacável usando uma sutura cirúrgica 4-0 na veia jugular direita na extremidade distal do coração para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo e faça uma incisão de 1,5 cm na veia jugular direita perto do coração.
  4. Inserir um estilete de cateter em forma de agulha (comprimento 25 mm, diâmetro 0,7 mm, ver Tabela de Materiais) na veia jugular direita em direção à extremidade proximal do coração do rato, inserir a sonda de microdiálise sanguínea (comprimento total da sonda 24 mm, comprimento da membrana 10 mm) em um cateter e implantar a sonda com pinça oftálmica ao longo da incisão oblíqua do estilete do cateter19.
  5. Remova o estilete do cateter guiado e mergulhe totalmente a membrana semipermeável da sonda (comprimento da membrana 10 mm, diâmetro da membrana 0,5 mm) na veia jugular direita. Desvende o slipknot destacável na extremidade distal do coração para restaurar o fluxo sanguíneo na veia jugular direita.
  6. Ligadura da sonda com a veia jugular direita com suturas cirúrgicas 4-0 e rosqueamento subcutâneo do tubo caudal da sonda através da parte posterior do pescoço. Consulte a Figura 2 para obter as etapas específicas de implantação da sonda.
    NOTA: O ponto de corte molecular pela sonda de microdiálise sanguínea utilizada neste estudo é de >20 kD. As amostras de sangue coletadas contêm substâncias com peso molecular inferior a 20 kD.

4. Amostragem de microdiálise

  1. Uma semana após o implante da sonda de microdiálise, os ratos que se recuperam de trauma cirúrgico são submetidos à amostragem de microdiálise. Coloque o rato acordado em um tanque de movimento livre (consulte a Tabela de Materiais) e conecte a sonda ao sistema de microdiálise. Equilibrar a membrana de diálise da sonda irrigando as DACs com uma taxa de 2 μL/min por 1 h.
  2. Coletar amostras de sangue de microdiálise a uma taxa de fluxo de 2 μL/min e mantê-las temporariamente em um recipiente fracionado de 4 °C.
    NOTA: As amostras de sangue obtidas podem ser testadas diretamente por centrifugação a 20.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Ou pode ser armazenado a -80 °C para os testes seguintes. Na coleta de amostras, é importante sempre observar se a sonda prolapsa e/ou vazamento.

5. Operação pós-amostragem

  1. Anestesiar os ratos SD com isoflurano a 2% em uma mistura ar-oxigênio a 0,6 L/min.
  2. Dissecção para confirmar novamente que a sonda está na veia jugular direita. Retire a sonda de microdiálise da veia jugular direita e coloque-a em água ultrapura.
  3. Finalmente, eutanasiar os ratos por inalação de isoflurano a 5%.
  4. Conecte a sonda à tubulação e enxágue durante a noite a uma taxa de 2 μL/min com água ultrapura para lavar completamente o sal residual no tubo e na sonda.
  5. Retire a sonda e mergulhe-a em água ultrapura. Conservar a 4 °C para evitar que a membrana de diálise da sonda se contraia.
    NOTA: Se o volume de líquido de diálise for inconsistente com o volume de fluido de perfusão, a sonda pode ser bloqueada pelo sangue coagulado. A sonda pode ser colocada na solução de proteína pancreática até que a substância visível se desfaça da ponta da membrana da sonda.

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Resultados

O presente protocolo permitiu a obtenção do sangue cardíaco de ratos conscientes de acordo com parâmetros de amostragem estabelecidos no equipamento de microdiálise. As amostras de sangue normais devem ser vermelhas brilhantes, enquanto os animais com hipóxia, potenciais coágulos sanguíneos ou doença anêmica podem ter roxo escuro ou vermelho escuro. As amostras obtidas pela técnica de microdiálise sanguínea são incolores, claras e transparentes, podendo ser utilizadas para analisar os marcadores séricos de diferentes doe...

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Discussão

As DCV são uma doença crônica comum nas clínicas, com incidência gradativamente crescente na China, e a idade de início tende a ser mais jovem, causando preocupação e pânico na maioria dospacientes20,21. Sendo a principal causa de morte no mundo, as DCV podem induzir infarto cerebral e outras doenças de alta mortalidade, ameaçando seriamente a vida saudável dos pacientes22. As DCV, incluindo cardiopatia isquêmica, cardiomiopatia, ateroscle...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82104533), pela Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2020M683273), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da província de Sichuan (2021YJ0175) e pelo projeto de P&D chave do Plano Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022YFS0438). Enquanto isso, os autores gostariam de agradecer ao Sr. Yuncheng Hong, engenheiro de equipamentos sênior da TRI-ANGELS D&H TRADING PTE. (cidade de Cingapura, Cingapura), para prestação de serviços técnicos para técnicas de microdiálise.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de anestesia animalRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Mantenedor de temperatura animalRayward Life Technology Co., Ltd69020
Sonda de microdiálise sanguínea Cateter CMA Microdialysis ABT55347
  CMA Microdiálise ABT55347
CitratoMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd251275
Barbeador elétricoRayward Life Technology Co., LtdCP-5200
Tubulação Fep  Tanque de Livre Circulação CMA Microdialysis AB3409501
para animais  CMA Microdiálise ABCMA120
GlicoseMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., LtdG8270
Pinça hemostáticaRayward Life Technology Co., LtdF21020-16
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
Micro tesouraBeyotime Biotechnology Co., LtdFS221
Microdiálise tubo de coleta  Coletor de microdiálise CMA Microdialysis AB7431100
CMA Microdialysis ABCMA4004
Microdiálise in vitro stand  Bomba de microinjeção de microdiálise CMA Microdialysis ABCMA130
CMA Microdialysis AB788130
Seringa para microdiálise (1,0 mL)  Adaptador de tubo de microdiálise CMA Microdialysis AB8309020
CMA Microdiálise AB3409500
Membrana filtrante microporosaMerck Millipore Ltd.
Suturas cirúrgicas não absorvíveisShanghai Tianqing Biological Materials Co., LtdS19004
Mesa de operaçãoYuyan Scientific Instrument Co., Ltd30153
Pinça oftálmicaRayward Life Technology Co., LtdF12016-15
Citrato de sódioMerck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd1613859
Sprague Dawley  (SD) ratosChengdu Dossy Experimental Animals Co., LtdSYXK(figure-materials-1)2019-049
Tesoura cirúrgicaRayward Life Technology Co., LtdS14014-15
Tesoura cirúrgicaShanghai Bingyu Fluid technology Co., LtdBY-103
Agulha de seringa  Líquido
Goote ultrassônico Co. de Guangdong GooteKMH1-240W8101
R0DB36622 de limpeza ultrassônico Guangdong da microdiálise de CMA, Ltd

Referências

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