Artigo de método

Imagem de autofluorescência para avaliar a fisiologia das algas vermelhas

DOI:

10.3791/64533

⸱

17 de fevereiro de 2023

 ,  , 
1Microscopy Core Facility, Technological Research and Scientific Area (ACTI), University of Murcia, 2Confocal Microscopy and Cellular Imaging Unit, Genetic and Molecular Medicine Department, Pediatric Institute for Rare Diseases, Hospital Sant Joan de Déu, 3Research Institute Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Spain 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia, 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve imagens de autofluorescência passo a passo e avaliação de alterações ficobiliproteicas em algas vermelhas com base na análise espectral. Este é um método livre de rótulos e não destrutivo para avaliar a adaptação celular a habitats extremos, quando apenas material escasso está disponível e as células crescem lentamente, ou não, em condições de laboratório.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As algas vermelhas (Rhodophyta) contêm ficobiliproteínas e colonizam habitats com pouca luz, no entanto, algumas (por exemplo, algumas espécies de Chroothece ) também podem se desenvolver em plena luz solar. A maioria dos rodófitos são vermelhos, no entanto, alguns podem parecer azulados, dependendo da proporção de biliproteínas azuis e vermelhas (ficocianina e ficoeritrina). Diferentes ficobiliproteínas podem capturar a luz em diversos comprimentos de onda e transmiti-la para a clorofila a, o que torna possível a fotossíntese sob condições de luz muito diferentes. Esses pigmentos respondem a mudanças de habitat na luz, e sua autofluorescência pode ajudar a estudar processos biológicos. Usando o Chroothece mobilis como um organismo modelo e o modo de varredura lambda espectral em um microscópio confocal, a adaptação de pigmentos fotossintéticos a diferentes luzes monocromáticas foi estudada no nível celular para adivinhar as condições ideais de crescimento da espécie. Os resultados mostraram que, mesmo quando a cepa estudada foi isolada de uma caverna, ela se adaptou a intensidades de luz fraca e média. O método apresentado é especialmente útil para estudar organismos fotossintéticos que não crescem ou crescem muito lentamente em condições de laboratório, o que geralmente é o caso daqueles que vivem em habitats extremos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As algas vermelhas, como o gênero Chroothece, podem crescer em habitats extremos, onde frequentemente têm que lidar com mudanças ambientais marcantes1. Inundações e secas são frequentes em regiões semiáridas onde esse gênero pode ser encontrado, e algumas espécies têm sido relatadas em riachos, falésias, cavernas ou mesmo águas termais2. No entanto, na maioria das vezes, variáveis biológicas, como competição ou pastoreio, relegam as espécies a condições não ótimas para o seu crescimento. Como esses organismos são muitas vezes difíceis de cultivar e não crescem ou crescem muito lentamente em condições de laboratório, uma grande limitação é o tamanho da amostra disponível. Portanto, é muito importante seguir métodos não destrutivos ou que envolvam manipulação mínima da amostra 3,4.

As habilidades fisiológicas necessárias para sobreviver nesses ambientes hostis podem ser monitoradas seguindo as mudanças em seus sistemas fotossintéticos. Mecanismos metabólicos, eficiência fotossintética e sensibilidade à luz ou condições de cultura podem ser revelados por perfis de emissão de fluorescência de pigmentos, devido a mudanças precisas em sua transferência de energia ou aprisionamento 5,6,7,8.

A autofluorescência de compostos celulares pode ser utilizada como marcador para citodiagnóstico ou como indicador natural do estado celular ou metabolismo em resposta a sinais externos e internos por meio de alterações na emissão9. Também pode ser usado para discriminar taxonomicamente diferentes grupos de organismos fotossintéticos10. Dependendo da posição filogenética de microrganismos fototróficos, pode-se encontrar diferentes características de fluorescência in vivo. Portanto, uma identificação taxonômica baseada nas características in vivo da fluorescência fototrófica (incluindo espectros de absorção e emissão de fluorescência) tem sido tentada em várias ocasiões11,12. Devido à diversidade de pigmentos acessórios entre os táxons fitoplâncton, diferenças nos comprimentos de onda nos quais a fluorescência da clorofila a (Chl a) é estimulada, ou diferenças nos espectros de emissão, podem ser usadas para inferir taxonomia13. Os espectros de excitação e emissão de fluorescência in vivo desses espécimes dependem não apenas do filo de algas, mas também da adaptação do fotossistema14. A eficiência da transferência de energia para Chl a, ou a razão de Chl a para pigmentos acessórios, e o conteúdo de pigmentos celulares são sensíveis às condições de crescimento5.

As algas vermelhas, particularmente Chroothece, têm vários pigmentos fluorescentes acessórios - ficobiliproteínas e carotenoides; os primeiros concentram-se em ficobilissomas ligados aos tilacóides dos cloroplastos. As ficobiliproteínas (ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina) podem capturar a luz em diferentes comprimentos de onda e transmiti-la para Chl a, o que possibilita a fotossíntese em condições de luz e cultura muito diferentes15. Por exemplo, as espécies de Chroothece podem crescer dentro de cavernas ou quase emergir em riachos calcários ligeiramente salinos2.

As luzes monocromáticas afetam o crescimento e a composição pigmentar de organismos fotossintéticos e têm sido estudadas para prevenir ou controlar o crescimento de organismos fotossintéticos em cavernas. Mulec et al. mostraram que a iluminação enriquecida com vermelho promove o crescimento de cianobactérias, algas e plantas16. Estudos anteriores também relataram que a luz verde afeta a composição pigmentar das cianobactérias17, enquanto outros revelaram que a luz verde impede o crescimento da maioria dos organismos fotossintéticos e algumas cianobactérias exibem uma redução nos tilacóides e uma intensidade média de fluorescência mais fraca18.

Para entender a capacidade do Chroothece como um organismo modelo de superar condições adversas, células cultivadas foram expostas a intensidades de luz crescentes e luz monocromática (verde ou vermelha)15, para ver como ele lida com as condições sombrias das cavernas (onde a luz vermelha predomina). O protocolo aqui apresentado reproduz o efeito das variáveis acima mencionadas sobre as ficobiliproteínas de Chroothece no nível celular usando sua própria autofluorescência.

Atualmente, a fluorescência é comumente utilizada como ferramenta para estudar as respostas fisiológicas de plantas vasculares, microalgas, macroalgas e cianobactérias13,14,16. A microscopia de fluorescência confocal espectral é uma excelente ferramenta para estudos in vivo avaliarem a fisiologia de espécimes fotossintéticos no nível unicelular 10,17,18,19,20, evitando problemas associados à baixa taxa de crescimento em laboratório e às dificuldades de obtenção de biomassa suficiente para os métodos de extração e bioquímicos associados8 . Uma vez que as células são tratadas sob diferentes condições de cultura por 2 semanas, o perfil de varredura lambda pode ser medido in vivo. Embora existam várias publicações em que diferentes comprimentos de onda de excitação por imagem confocal tenham sido utilizados 3,4,10,17, a maioria das ficobiliproteínas e Chl a pode ser detectada usando uma linha de excitação de comprimento de onda de 561 nm, e a emissão detectada varia de 570 a 760 nm de comprimento de onda. Esses critérios foram baseados em uma análise previamente realizada 10 com pigmentos puros comerciais (Tabela 1) por imagem confocal e nos resultados obtidos em diferentes espécies de algas20,21,22.

Pigmentosλflmax (nm)λ exc (nm)
351364458476488514543633
Chl a660.9-678.143,4 ± 1,811,2 ± 0,21,8 ± 0,052,0 ± 0,0812,2 ± 0,76,0 ± 0,34.2 ± 0.1680,7 ± 1,5
R-PE569.2-583.35,9 ± 0,65,9 ± 0,1611,1 ± 0,0442,2 ± 0,3100,0 ± 090,0 ± 0,399,2 ± 0,08-
652.1-668.6--1,5 ± 0,013,7 ± 0,0426,7 ± 0,58,7 ± 0,1611,1 ± 0,1611,3 ± 0,2
C-PC636.2-676.42,3 ± 0,041,0 ± 0,010,6 ± 0,0040,7 ± 0,0082,0 ± 0,082,0 ± 0,043,3 ± 0,1633,6 ± 0,9
APC-XL667.3-683.815,1 ± 1,59,6 ± 0,981,0 ± 0,041,2 ± 0,085,9 ± 0,74,1 ± 0,523,2 ± 3,591,4 ± 2,3

Tabela 1: As informações de pigmento puro usadas para executar a análise de varredura lambda. Esta tabela mostra os picos de emissão e os máximos de ombros/banda de fluorescência de diferentes fluorocromos/pigmentos por espectrofotometria de imagem confocal para todos os comprimentos de onda de excitação e a porcentagem de emissão de luz por pigmentos/fluorocromos. Os valores foram calculados pela fórmula: = IFM*100/255. Cada valor é a média ± SE (média ± erro padrão da média). Pigmentos puros foram utilizados para calibrar o microscópio a laser de varredura confocal da seguinteforma 1,2,10. A clorofila a foi obtida de Spinacia oleracea, R-ficoeritrina (R-PE) de Porphyra tenera e C-ficocianina (C-PE) de Spirulina sp. Todas as espécies foram dissolvidas em água destilada filtrada. A aloficocianina-XL (APC-XL) foi obtida de Mastigocladus laminosus, que foi dissolvido em sulfato de amônio (60%) e fosfato de potássio (pH = 7) para atingir uma concentração de 38 mM. Os exames foram realizados com 400 μL de cada solução pigmentar (concentração de 1 mg/mL) utilizando uma câmara de fundo de vidro coberto de 8 poços.

O estudo de um único comprimento de onda de excitação é uma primeira aproximação bastante útil. Neste caso, no entanto, é necessário elucidar a contribuição relativa dos diferentes complexos no sinal de fluorescência, o que é recomendado para realizar uma razão de fluorescência ou análise de espectro em vários comprimentos de onda, entre outros métodos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A espécie de algas Chroothece mobilis foi utilizada para o presente estudo. A espécie foi obtida a partir da coleção de cultura Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Visão geral do estudo. Chroothece mobilis é incubado sob condições extremas de habitat, como diferentes luzes monocromáticas, por 2 semanas. O efeito sobre a fisiologia de Chroothece é avaliado pela autofluorescência das proteínas contidas no ficobilissoma e fotossistemas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da amostra

  1. Preparar o inóculo de Chroothece mobilis a partir da cultura de ágar da coleção, transferindo-o para o meio líquido SWES (Tabela 2).
    NOTA: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = meio de água do mar23.
  2. Manter todas as culturas durante 2 semanas com um fotoperíodo claro/escuro de 16:8 a 20 °C em condições de baixa intensidade de luz branca (LL: 80 μM/m2/s) e sem agitação, até se obter a densidade celular desejada (ver passo 1.3).
    NOTA: As condições de luz de crescimento são de intensidade de luz de 80 μM/m2/s (radiação fotossintética ativa, PAR). Essas condições são usadas como as condições de pouca luz (controle). A composição do meio SWES é apresentada na Tabela 2.
  3. Realizar inoculações para os diferentes experimentos na fase de cultura exponencial com densidade celular de 5 x 103 células/mL em placa de 24 poços, utilizando 1 mL por poço.
    NOTA: Realizar a contagem celular com uma câmara de Neubauer24 e diluir a cultura com SWES sempre que necessário.

Composição média SWES
ComponenteConcentração
KNO31.98 mM
K2HPO4115 μM
MgSO481 μM
ZnSO4, 7H2O17 nM
MnSO4, 7H2O45 Nm
H 3BO3, 4H2O3,1 mM
Co(Nº3)217 mM
Na 2 MoO4, 6H2O21 nM
CuSO4, 2H2O0,1 nM
FeSO4, 5H2O13 μM
EDTA, 7H2O11 μM
Vit B125 μg
Extrato do solo30 mL
Água filtrada do rio455 mL

Tabela 2: Composição média SWES.

2. Reprodução de condições extremas de habitat de algas: efeito de luz monocromática verde e vermelha

  1. Adicionar 1 ml da cultura celular da cultura de reserva preparada à densidade celular acima referida (passo 1.2) para inocular cada poço de uma placa de 24 poços.
  2. Mantenha a cultura celular coberta por 2 semanas para reproduzir o efeito de luz monocromática.
    1. Use o filtro verde que permite que a luz verde passe de 470 a 570 nm com um pico no comprimento de onda de 506 nm (de acordo com as especificações do fabricante; consulte Tabela de Materiais) e exponha à cultura25.
    2. Use o filtro vermelho que permite a luz vermelha entre 590 e 720 nm e picos de 678 nm (de acordo com as especificações do fabricante; ver Tabela de Materiais) para expô-lo à cultura25.
      NOTA: A condição de baixa intensidade de luz branca (LL: 80 μM/m2/s; ver Tabela de Materiais) é usada como controle de intensidade de luz para comparar os efeitos obtidos. As unidades de intensidade de luz empregadas são micromol por segundo e metro quadrado (μmol m-2 s-1) ou densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (PPFD).

3. Imagem de autofluorescência

NOTA: A configuração do software de geração de imagens (consulte Tabela de materiais) é ilustrada na Figura 2.

  1. Ligue todos os componentes do microscópio de varredura a laser confocal invertido (CLSM; consulte Tabela de materiais), incluindo o laser.
  2. Monte as células de cada poço experimental da placa de 24 poços em meio de crescimento SWES até um prato de fundo de vidro de 35 mm (ver Tabela de Materiais) para geração de imagens.
  3. Escolha a objetiva de imersão de glicerol 63x/1.30 NA e coloque o glicerol sobre a lente (consulte Tabela de Materiais).
  4. Coloque a placa do poço no estágio do microscópio e certifique-se de que a amostra não se mova durante a aquisição da imagem.
  5. Centralize a amostra no caminho da luz e concentre-se no centro da célula, selecionando o plano com a maior intensidade de fluorescência.
  6. Abra o software de aquisição de imagens e escolha xyλ na lista suspensa no modo de aquisição26.
  7. Selecione a linha de excitação do laser para DPSS de 561 nm, 8 bits de faixa dinâmica e 1024 x 1024 pixels.
    NOTA: Certifique-se de que o microscópio confocal tenha um laser DPSS de 561 nm ou um laser de luz branca (WLL).
  8. Coletar os espectros de emissão de fluorescência na largura de banda de 10 nm e o tamanho da etapa lambda de 4 nm dentro da faixa de 570-760 nm.
  9. Defina o orifício em 1 unidade Airy e execute a aquisição da varredura lambda.
  10. Repita esse processo o maior número de vezes possível em diferentes campos de visão para coletar uma quantidade aceitável de dados para análise estatística (geralmente um desvio padrão inferior a 10%22).
  11. Repita a última etapa sob as diferentes condições (sob luzes vermelhas e verdes) e salve os dados.
    NOTA: Use as mesmas configurações de aquisição para as diferentes amostras e condições para comparar e conduzir a análise estatística.

figure-protocol-2
Figura 2: Configuração do software. Interface do usuário do software de geração de imagens para configurar os parâmetros de varredura lambda. (A) Da esquerda para a direita, para selecionar o modo de aquisição xyλ na lista suspensa, que corresponde à etapa 3.6 do protocolo, e para selecionar o tipo de lente de imersão direita, correspondente à etapa 3.3 do protocolo. Certifique-se de remover qualquer filtro do caminho da luz na etapa 3.9. (B) O painel para configurar os parâmetros de varredura lambda corresponde à etapa 3.8 do protocolo. (C) Execute a verificação lambda na etapa 3.10. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Parâmetros para avaliar a fisiologia de Chroothece

  1. Uma vez que a varredura lambda é adquirida, clique na janela quantificar na parte superior do software (como mostrado na Figura 3) para avaliar os espectros de emissão de fluorescência coletados. Vá para a janela Open project e selecione um arquivo xyλ (Figura 3).
  2. Selecione Stack profile analysis (Análise de perfil de pilha ) no software de geração de imagens.
  3. Definir uma região de interesse (ROI) de 4 μm2 no centro de uma célula para analisar a intensidade média de fluorescência (MFI). Exporte os dados no formato CSV.
    NOTA: É importante evitar a presença de pixels pretos (para garantir que os pixels selecionados contenham valores positivos) e sempre manter um ROI do mesmo tamanho.
  4. Repita este processo com células diferentes sob diferentes condições para produzir dados suficientes para realizar análises estatísticas.
  5. Abra os arquivos CSV para selecionar os diferentes picos de emissão de fluorescência das ficobiliproteínas e clorofilas de todos os ROIs medidos.
    1. Selecione os dados de fluorescência de ficoeritrina-ficocianobilina (PE-PCB; 620 nm), C-ficocianina (CPC; 648 nm), aloficocianina (APC; 660 nm) e clorofila a (Chl a; 680 nm), respectivamente, no arquivo csv.
  6. Crie uma nova tabela com todos os valores máximos de fluorescência obtidos de cada pico de ficobiliproteína e clorofila e plote os dados em um gráfico.
  7. Realizar análises estatísticas.
    1. Analisar se os dados obtidos atendem à normalidade e homocedasticidade27.
    2. Prossiga para a análise do teste t27,28 se a primeira condição for verdadeira. Caso contrário, execute um teste U de Mann-Whitney29.
    3. Considere-se as diferenças significativas nos valores de p <0,05.

figure-protocol-3
Figura 3: Avaliando a autofluorescência de Chroothece. Para realizar a análise de autofluorescência, certifique-se de selecionar a janela quantificar e um arquivo xyλ na janela de projetos aberta (etapa 4.1); selecionar visualização de perfil de pilha (etapa 4.2); selecione um ROI de 4 μm2 no centro de uma célula e clique no botão de relatório para exportar os dados da varredura lambda no formato CSV (etapa 4.3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A clorofila a geralmente absorve os comprimentos de onda azul e vermelho da luz visível, enquanto as ficobiliproteínas usam comprimentos de onda verde, amarelo e laranja7. A autofluorescência desses pigmentos possibilita a primeira abordagem para estudar ficobiliproteínas e o comportamento da clorofila em condições experimentais e de campo.

Comparando-se os dados obtidos e plotando-se em diferentes gráficos, pode-se distinguir mudanças significativas na intensidade médi...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algumas algas vermelhas unicelulares ou coloniais, como Chroothece, crescem lentamente in vitro, mas contêm vários compostos autofluorescentes que podem ser analisados por análise espectral sob um microscópio confocal, onde diferenças nos picos de emissão de pigmentos podem ser detectadas. A microscopia de fluorescência confocal espectral tem permitido a realização de estudos in vivo para avaliar a adaptação ou aclimatação de organismos fotossintéticos 8,10,17,18,19,20.<...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi realizada como parte dos Projetos TIN2015-68454-R e 20961/PI/18, financiados pelo Ministério da Economia e Competitividade espanhol e pela Fundação Séneca da Região de Múrcia. Irene Hernández Martínez e Francisco Javier Ibáñez López, da Seção de Apoio Estatístico da Área Científica e de Pesquisa da Universidade de Múrcia (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figura 1 foram desenhados usando imagens da Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier está licenciado com uma Licença Creative Commons Attribution 3.0 Unported (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
µ-Prato 35 mm, fundo de vidro altoIbidi;81158-24
placa de poço pretoIbidi82406  fundo plano e transparente para microscopia de alto rendimento
Incubadora de AlgasPanasonicMLR-352-PE
Microscópio confocal de varredura a laserLeica MicrosystemsSP8 TCS-Flask
Fisher Scientific15380591Pode ser adquirido em uma loja de conveniência local ou lojas online.
filtro verdePNTA, filtros LEE-Podem ser adquiridos em uma loja de conveniência local ou lojas online.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2Leica Microsystems506353Lente de imersão em glicerol
Software de aquisição de imagem. LAS XLeica MicrosystemsSP8 TCS-Fonte
de luzPanasonicFL40SSENW/37MLR-352-PE
Fotoradiômetro quânticoDeltaOhm Software DO 9721-R
R Core Team, 20204.0.2.-
filtro vermelhoPNTA, filtros LEE-Pode ser comprado em uma loja de conveniência local ou lojas online.
SWES mediumUniversidade de Murcia--
Líquido de imersão tipo GLeica Microsystems11513910Glicerol 

Referências

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