Method Article

Avaliando as Propriedades Anticriptocócicas Putativas de Extratos Brutos e Clarificados de Moluscos

DOI:

10.3791/64540

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December 2nd, 2022

 ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph, 2School of Environmental Sciences, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produz uma variedade de fatores de virulência (por exemplo, peptidases) para promover sua sobrevivência dentro do hospedeiro. Os nichos ambientais representam uma fonte promissora de novos inibidores naturais da peptidase. Este protocolo descreve a preparação de extratos de moluscos e a avaliação do seu efeito na produção do fator de virulência fúngica.

Abstract

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Cryptococcus neoformans é um patógeno fúngico humano encapsulado com uma distribuição global que infecta principalmente indivíduos imunocomprometidos. O uso generalizado de antifúngicos em ambientes clínicos, seu uso na agricultura e hibridização de cepas levaram ao aumento da evolução da resistência. Esta crescente taxa de resistência contra antifúngicos é uma preocupação crescente entre clínicos e cientistas em todo o mundo, e há uma maior urgência em desenvolver novas terapias antifúngicas. Por exemplo, C. neoformans produz vários fatores de virulência, incluindo enzimas intra e extracelulares (por exemplo, peptidases) com papéis na degradação tecidual, regulação celular e aquisição de nutrientes. A interrupção da atividade dessa peptidase por inibidores perturba o crescimento e a proliferação de fungos, sugerindo que esta pode ser uma estratégia importante para o combate ao patógeno. É importante ressaltar que invertebrados, como moluscos, produzem inibidores da peptidase com aplicações biomédicas e atividade antimicrobiana, mas são pouco explorados em termos de seu uso contra patógenos fúngicos. Neste protocolo, uma extração global de moluscos foi realizada para isolar potenciais inibidores da peptidase em extratos brutos e clarificados, e seus efeitos contra fatores clássicos de virulência criptocócica foram avaliados. Este método suporta a priorização de moluscos com propriedades antifúngicas e oferece oportunidades para a descoberta de agentes antivirulência, aproveitando os inibidores naturais encontrados em moluscos.

Introduction

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Cryptococcus neoformans é um patógeno fúngico humano que produz doença grave em hospedeiros imunocomprometidos, como indivíduos vivendo com HIV/AIDS1, e leva a aproximadamente 19% das mortes relacionadas à AIDS2. O fungo é suscetível a várias classes de antifúngicos, incluindo azóis, polienos e flucitosina, que exercem atividade fungicida e fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. No entanto, o uso extensivo de antifúngicos em ambientes clínicos e agrícolas, combinado com a hibridização de cepas, amplificou a evolução da resistência em múltiplas espécies de fungos, incluindo C. neoformans5.

Para superar os desafios da resistência antifúngica e reduzir a prevalência de infecções fúngicas em escala global, uma abordagem promissora é usar os fatores de virulência de Cryptococcus spp. (por exemplo, adaptabilidade à temperatura, cápsula de polissacarídeos, melanina e enzimas extracelulares) como potenciais alvos terapêuticos 4,6 . Essa abordagem tem várias vantagens, pois esses fatores de virulência estão bem caracterizados na literatura, e direcionar esses fatores poderia potencialmente reduzir as taxas de resistência antifúngica, impondo uma pressão seletiva mais fraca por meio da virulência prejudicada, em vez de visar o crescimento celular6. Nesse contexto, inúmeros estudos têm avaliado a possibilidade de direcionar enzimas extracelulares (por exemplo, proteases, peptidases) para reduzir ou inibir a virulência de Cryptococcus spp.7,8,9.

Organismos como invertebrados e plantas não possuem um sistema imunológico adaptativo para se proteger de patógenos. No entanto, eles dependem de um forte sistema imunológico inato com uma imensa variedade de compostos químicos para lidar com micro-organismos e predadores10. Essas moléculas incluem inibidores de peptidase, que desempenham papéis importantes em muitos sistemas biológicos, incluindo os processos celulares da imunidade de invertebrados, como a coagulação da hemolinfa, a síntese de citocinas e peptídeos antimicrobianos e a proteção dos hospedeiros pela inativação direta das proteases de patógenos11. Assim, inibidores de peptidases de invertebrados, como moluscos, possuem potenciais aplicações biomédicas, mas muitos permanecem descaracterizados10,12,13. Neste contexto, existem aproximadamente 34 espécies de moluscos terrestres em Ontário e 180 moluscos de água doce no Canadá14. No entanto, seu perfil e caracterização aprofundados ainda são limitados15. Esses organismos apresentam uma oportunidade para a identificação de novos compostos com potencial atividade antifúngica10.

Neste protocolo, são descritos métodos para isolar e esclarecer extratos de invertebrados (por exemplo, moluscos) (Figura 1) seguidos da medição da atividade inibitória da peptidase putativa. As propriedades antifúngicas desses extratos são então avaliadas medindo-se seu impacto na produção do fator de virulência de C. neoformans por meio de ensaios fenotípicos (Figura 2). É importante notar que as diferenças nas propriedades antifúngicas entre extratos brutos e clarificados podem ser indicativas de fatores microbianos (por exemplo, metabólitos secundários ou toxinas produzidas pelo microbioma hospedeiro) do molusco, o que pode influenciar as observações experimentais. Tais achados reforçam a necessidade de este protocolo avaliar extratos brutos e clarificados de forma independente para desvendar os modos de ação. Além disso, o processo de extração é imparcial e pode permitir a detecção de propriedades antimicrobianas contra uma infinidade de patógenos fúngicos e bacterianos. Portanto, este protocolo fornece um ponto de iniciação para a priorização de espécies de moluscos com propriedades antifúngicas contra C. neoformans e uma oportunidade para avaliar as conexões entre a atividade enzimática e a produção do fator de virulência através de mecanismos inibitórios putativos.

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Protocol

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1. Extracção de proteínas a partir de moluscos

  1. Coletar moluscos de uma área natural designada e aprovada (por exemplo, Speed River, Guelph, Ontário). Para este estudo, espécies nativas e invasoras foram selecionadas para avaliar uma ampla gama de potenciais efeitos antifúngicos.
  2. Quebre suavemente a casca dos moluscos (por exemplo, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi e Cipangopaludina chinensis) usando um pilão e argamassa, e remova os pedaços sólidos com um par de pinças. Geralmente, 10 moluscos são agrupados para uso em todo o protocolo.
  3. Coletar e pesar os órgãos. Aproximadamente 15-20 g de amostra é o ideal. Use uma tesoura para cortar os órgãos em pequenos pedaços de aproximadamente 0,5-1 cm de tamanho.
  4. Congelar rapidamente as amostras de órgãos dissecadas e cortadas com nitrogênio líquido. Em seguida, moa as amostras de órgãos em um pó fino usando um pilão e argamassa.
  5. Adicionar o pó da amostra de órgão (aproximadamente 15 g) em 30 ml de água destilada fria (4 °C) para obter uma relação de 1:2 (p/v).
  6. Despeje 2 mL da amostra em tubos de 2 mL de alto impacto. Adicione uma colher de 3 mm de esferas de aço inoxidável (aproximadamente 500 μg) a cada tubo e homogeneize usando um liquidificador (ver Tabela de Materiais) por 3 minutos a 1.200 rpm e 4 °C.
  7. Centrífuga a 12.000 × g durante 20 min a 4 °C. Recolher todos os sobrenadantes com uma pipeta num tubo fresco de 50 ml, descartando o pellet.
  8. Filtrar-esterilizar o sobrenadante usando uma membrana de 0,22 μm. Armazenar as amostras no gelo e proceder ao protocolo de clarificação (secção 2), conforme aplicável.
    NOTA: As amostras podem ser congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -20 °C para serem usadas como extratos brutos.

2. Clarificação do extracto de molusco

  1. Colocar a amostra sobrenadante da etapa 1.8 num banho termal a 60 °C durante 30 minutos. Em seguida, resfrie as amostras rapidamente, transferindo-as para um balde com gelo por 20 min.
  2. Centrifugar as amostras a 15.000 × g durante 45 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante num tubo fresco de 50 ml e descarte o pellet. Filtre-esterilize as amostras usando um filtro de membrana de 0,22 μm e, em seguida, armazene-as no gelo.
  3. Determine a concentração de proteína nas amostras da etapa 1.8 (ou seja, o extrato bruto) e da etapa 2.2 (ou seja, o extrato clarificado) usando um ensaio de quantificação (por exemplo, ensaio de ácido bicinchonínico17). A faixa de concentração de proteína ideal é de 4-8 mg / mL.
  4. Armazenar as amostras no gelo por até 1 h ou congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazená-las a -20 °C até que seja necessário.

3. Ensaio de atividade inibitória

  1. Medir a atividade inibitória dos extratos brutos e clarificados usando ensaios enzimáticos em triplicado técnico.
    NOTA: Cada ensaio enzimático consiste em uma enzima (por exemplo, subtilisina A, que está envolvida na virulência fúngica 16,17,18; geralmente em torno de 1 x 10−9 mol/L para ensaios à base de cromogenia), um tampão e um substrato. A reação começa quando o substrato encontra a enzima. A atividade enzimática é proporcional à taxa de conversão do substrato no produto.
  2. Avaliar o efeito da concentração enzimática (CE) sobre a atividade enzimática (EA) até que a dependência linear seja obtida entre ambos os parâmetros. Para as próximas etapas, use uma concentração enzimática dentro da faixa linear medida.
    NOTA: O ensaio enzimático para a peptidase subtilisina A é detalhado nas etapas a seguir.
  3. Incubar os extractos de proteína de moluscos brutos (passo 1.11) ou clarificados (passo 2.5) (por exemplo, 10 μL contendo 4 mg/ml de proteína) com 10 μL de subtilisina A (concentração determinada a partir do passo 3.2) e 220 μL de Tris-HCl de 100 mM a pH 8,6 (para o controlo, adicionar 230 μL de tampão Tris sem adicionar o extracto) durante 10 minutos a 25 °C numa placa de fundo plano de 96 poços.
  4. Adicionar 10 μL de N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, o substrato para a subtilisina A, a uma concentração final de 1 K m (constante de Michaelis-Menten; 0,2mM para este substrato com subtilisina A) para um volume de reação final de 250 μL.
  5. Meça a atividade enzimática monitorando a aparência do produto ao longo do tempo lendo a densidade óptica (OD) a 405 nm a cada 15 s por 3 min.
  6. Determinar a actividade enzimática residual calculando a razão entre a actividade enzimática na presença do extracto de molusco e a actividade enzimática na ausência do extracto.
  7. Se for observada atividade inibitória (ou seja, atividade residual abaixo de 1), meça o valor da concentração inibitória 50 (IC50) usando uma faixa de concentrações dos extratos (por exemplo, uma série de diluição dupla de 200 μg/mL a 1 μg/mL) seguindo métodos padrão19.

4. Efeito de extratos de moluscos sobre o crescimento de C. neoformans

  1. Use uma ponta de pipeta de 10 μL para introduzir uma única colônia de C. neoformans var. grubii H99 tipo selvagem (WT) em 5 mL de meio extrato de levedura-peptona-dextrose (YPD) (extrato de levedura 10 g/L, peptona 20 g/L e dextrose 20 g/L, pH 6,5), e incubar por 16-18 h a 30 °C e 200 rpm. Realizar o experimento em triplicado biológico e duplicado técnico.
  2. Coletar 500 μL da cultura em uma cuvete e medir o crescimento lendo o OD a 600 nm. Diluir a cultura com meio de levedura à base de nitrogênio (YNB) até uma ODfinal 600 de 0,02.
  3. Co-cultura de células de C. neoformans com diferentes concentrações (por exemplo, uma série de diluição tripla de 440 μg/mL a 15 μg/mL de proteína) dos extratos (ou seja, brutos e clarificados). Para isso, misture 10 μL dos extratos com 190 μL da cultura diluída de C. neoformans (etapa 4.2) em uma placa de 96 poços.
  4. Meça o crescimento lendo o OD 600 usando um leitor de placas a cada 15 min a 1 h por 72 h a200 rpm e 37 °C.

5. Efeito de extratos de moluscos na produção de melanina de C. neoformans

  1. Preparar placas de L-3,4-di-hidroxifenilalanina (L-DOPA).
    1. Autoclave 230 mL de ágar 14 g/L e deixe esfriar até atingir 50-60 °C.
    2. Adicionar 3,25 mL de glicina 1 M, 7,35 mL de 1 M KH 2 PO 4, 2,5 mL de 1 M MgSO4,7H 2 O, 0,6 mL de glicose a 40%, 70 μL de tiamina 10 mM e2,5mL de 100 mM L-DOPA (esterilizado por filtro) ao ágar líquido.
    3. Despeje 15 mL da mistura em placas de Petri, deixe secar por aproximadamente 1 h no escuro e armazene a 2-4 °C por até 1 semana. Certifique-se de que as tampas estejam parcialmente levantadas para que o ágar seque adequadamente.
  2. Inocular 5 mL de meio YNB com 50 μL de cultura de C. neoformans a partir da etapa 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C e 200 rpm.
  3. Gire as células a 1.000 × g por 5 min a 4 °C. Lavar as células 2x com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a pH 7,4.
  4. Conte as células usando um hemocitômetro. Ressuspender as células em 1 mL de PBS para atingir uma concentração final de 10a 6 células/mL.
  5. Preparar uma série de diluição (por exemplo, dupla) dos extractos de moluscos brutos e clarificados. Da mesma forma, prepare uma série de diluição de 10 vezes de células de C. neoformans (etapa 5.4) de 1 x 106 células/mL para 1 x10 1 células/mL usando PBS estéril em placas de 96 poços.
  6. Espalhe 200 μL dos extratos em placas de Petri contendo ágar L-DOPA usando um cotonete e deixe secar por 15 min.
  7. Spot 5 μL de cultura de cada poço na placa de L-DOPA, deixando 1 cm entre as gotas. Deixe secar no escuro por 15 min.
  8. Incubar as placas a 30 °C e 37 °C em uma incubadora estática por 3-5 dias, capturando imagens a cada 24 h com uma câmera ou imageador de placas (por exemplo, scanner).
    NOTA: Duas condições de temperatura são usadas aqui para explorar a influência da temperatura sobre os efeitos inibitórios do crescimento dos extratos de moluscos, com 30 °C representando o ambiente e 37 °C representando temperaturas fisiológicas humanas.

6. Efeito de extratos de moluscos na produção de cápsulas de polissacarídeos de C. neoformans

  1. Prepare o meio com baixo teor de ferro (LIM) conforme descrito abaixo.
    1. Dissolver 5 g de resina quelante (ver Tabela de Materiais) em 60 ml de água ultrapura e embalar numa coluna de vidro (2 cm de diâmetro x 25 cm de comprimento). Lave a coluna com 100 mL de água e descarte a água coletada.
    2. Prepare água com pouco ferro (LI-água) passando 2 L de água ultrapura estéril através da coluna quelante. Conservar a água LI a 4 °C durante um período máximo de 3 meses.
    3. Dissolva 5 g de glicose em 100 mL de água LI. Dissolver 5 g de L-asparagina em 200 ml de água LI num copo separado.
    4. Adicionar o seguinte a 500 mL de água LI na ordem: 4,78 g de HEPES, 0,4 g de K 2 HPO 4, 0,08 g de MgSO 4,7H 2 O, 1,85 g de NaHCO 3 e 0,25 g de CaCl 2,2H 2O.
    5. Combine as soluções das etapas 6.1.3 e 6.1.4. Adicionar 1 mL de sal de sódio do ácido batofenantrolinedissulfônico (BPS) a 100 mM a uma concentração final de 100 μM.
    6. Ajuste o pH para 7,2 com 1 M LI-MOPS. Adicione a água LI a um volume final de 1 L e filtre-esterilize o meio passando-o através de uma membrana de 0,22 μm. Adicionar 100 μL de tiamina estéril (4 mg/mL) ao meio.
  2. Inocular 5 mL de meio YNB com 50 μL da cultura de C. neoformans a partir da etapa 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C e 200 rpm. Use esta cultura para inocular 5 mL de LIM até uma concentração final de 10a 5 células/mL.
  3. Adicionar volumes apropriados dos extratos de moluscos (por exemplo, uma diluição dupla ou o volume determinado a partir de ensaios de virulência anteriores) para atingir as concentrações desejadas. Incubar durante 72 h a 37 °C e 200 rpm com tampas soltas. Após incubação, coletar 1 mL de células e lavar 2x com PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g por 2 min a 4 °C.
  4. Ressussuscite suavemente as células em 1 mL de PBS. Misture as células com tinta da Índia na proporção de 1:1 (por exemplo, 4 μL de tinta da Índia com 4 μL de suspensão celular) sobre uma lâmina de microscópio de vidro. Coloque uma tampa em cima do slide.
  5. Visualize as amostras usando um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) com uma objetiva de óleo de 63x (consulte Tabela de Materiais). Defina o contraste como automático e foque manualmente usando o mostrador do microscópio. Selecione todas as imagens e exporte-as no formato TIFF. Nenhum filtro precisa ser aplicado.
  6. Usando a ferramenta de régua no ImageJ20, quantifique a proporção entre o tamanho total da célula (incluindo a cápsula) e o tamanho do corpo da célula.

7. Efeito de extratos de moluscos na produção de biofilme de C. neoformans

  1. Inocular 5 mL de meio YNB com 50 μL de cultura de C. neoformans a partir da etapa 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C e 200 rpm.
  2. Colher células da cultura de 5 mL. Lavar as células com PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C.
  3. Conte as células usando um hemocitômetro. Ressuspender as células em 3 ml do meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco até uma concentração final de 10a 7 células/ml.
  4. Transferir 300 μL da suspensão celular para os poços individuais de uma placa estéril de poliestireno e fundo plano de 24 poços. Use poços com mídia apenas como um controle.
  5. Adicione volumes apropriados dos extratos de molusco (por exemplo, uma diluição dupla ou o volume determinado a partir de ensaios de virulência anteriores) para atingir uma concentração final de 10-20 μg/mL de proteína. Certifique-se de que o volume de extrato não seja superior a 10% do volume total.
  6. Envolver as placas com papel alumínio (para evitar a evaporação do meio) e incubar durante 48 h utilizando uma incubadora estática a 30 °C e 37 °C.
  7. Usando uma garrafa ou dispensador, lave os poços 2x com água estéril e deixe-os secar ao ar por 10-15 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 μL de solução violeta cristalina a 0,3% a cada poço (incluindo os poços de controle somente de meio) e incube à temperatura ambiente por 10 min.
  8. Lave bem os poços 3x com água estéril (os biofilmes não serão interrompidos durante a lavagem). Adicione 200 μL de etanol a 100% e incube por 10 min no RT.
  9. Transfira 75 μL para uma nova placa de fundo plano de 96 poços e leia o OD550. Quantificar a formação do biofilme como (OD 550nm da amostra - OD550nm do branco).

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Results

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O fluxo de trabalho aqui descrito permite o isolamento de proteínas e peptídeos de moluscos com potenciais propriedades antivirulência contra C. neoformans. Da mesma forma, a avaliação de diferentes formas de extratos (ou seja, brutos e clarificados) permite a semipurificação dos compostos ativos potenciais e suporta a avaliação a jusante (por exemplo, proteômica baseada em espectrometria de massa). Normalmente, o fluxo de trabalho de extração de proteínas produz soluções homogeneizadas com concentrações proteic...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo de extração descrito aqui descreve o isolamento de compostos de moluscos coletados de Ontário, Canadá, e demonstra uma nova investigação do uso de extratos de moluscos contra o patógeno fúngico humano, C. neoformans. Esse protocolo se soma a um crescente corpo de pesquisas que investigam a atividade inibidora da peptidase a partir de invertebrados13. Durante a extração, algumas amostras de extrato foram de difícil filtragem-esterilização, possivelmente devido à presença de pol...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem aos membros do Laboratório Geddes-McAlister por seu valioso apoio ao longo desta investigação e seu feedback do manuscrito. Os autores reconhecem o apoio financeiro da Ontario Graduate Scholarship e International Graduate Research Award - University of Guelph para D. G.-G e da Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) e Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award for J. G.-M.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m FiltrosVWR28145-477 (América do Norte)
Tubos de 1,5 mL (Safe-Lock)Eppendorf0030120086
Tubos de 2 mL (Safe-Lock)Eppendorf0030120094
3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA)Sigma-AldrichD9628-5GCAS #: 59-92-7
Placas de 96 poçosCostar (Corning)3370
Bullet Liquidificador Storm 24NEXT ADVANCEBBY24M
Centrífuga 5430REppendorf5428000010
Chelex 100 ResinaBioRad142-1253
CO2 Incubadora (Estática)SANYONão disponível
Cryptococcus neoformans Microscópio H99ATCC208821
DICSoftware de microscópio Olympus
DICZeiss
DMEMCorning10-013-CV
Glicose (D-glicose, anidro, grau de reagente)BioShopGLU501CAS #: 50-99-7
GlycineFisher ChemicalG46-1CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9Dotmatics
HemocitômetroVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375
Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4,7 H2O)HoneywellM1880-500GCAS #: 10034-99-8 
PeptoneBioShopPEP403
Sal tampão de fosfatoto pH 7.4BioShopPBS408SKU: PBS408.500
Leitor de placas (Synergy-H1)BioTek (Agilent)Não disponível
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Fisher ChemicalP285-500CAS #: 7778-77-0
Subtilisin ASigma-AldrichP4860CAS #: 9014-01-01
Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidaSigma-Aldrich573462CAS #: 70967-97-4
Banho térmicoVWR76308-834
Cloridrato de tiaminaFisher-BioreagentsBP892-100CAS #: 67-03-8
Extrato de leveduraBioShopYEX401CAS #: 8013-01-2
Levedura base de nitrogênio (com Aminoácidos)Sigma-AldrichY1250-250GYNB 

References

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