O ensaio de micronúcleo (MN) é um teste bem estabelecido para quantificar danos ao DNA. No entanto, pontuar o ensaio usando técnicas convencionais, como microscopia manual ou análise de imagem baseada em recursos, é trabalhoso e desafiador. Este artigo descreve a metodologia para desenvolver um modelo de inteligência artificial para pontuar o ensaio de MN usando dados de citometria de fluxo de imagem.
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Artigo de método
Automação do Ensaio de Micronúcleos Utilizando Imagem por Citometria de Fluxo e Inteligência Artificial
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de micronúcleo (MN) é usado mundialmente por órgãos reguladores para avaliar produtos químicos quanto à toxicidade genética. O ensaio pode ser realizado de duas maneiras: pontuando MN em células binucleadas bloqueadas por citocinese ou células mononucleadas totalmente divididas. Historicamente, a microscopia óptica tem sido o método padrão-ouro para pontuar o ensaio, mas é trabalhosa e subjetiva. A citometria de fluxo tem sido usada nos últimos anos para pontuar o ensaio, mas é limitada pela incapacidade de confirmar visualmente aspectos-chave da imagética celular. A citometria de fluxo por imagem (IFC) combina captura de imagem de alto rendimento e análise automatizada de imagens, e tem sido aplicada com sucesso para adquirir rapidamente imagens e pontuar todos os eventos-chave no ensaio de MN. Recentemente, foi demonstrado que métodos de inteligência artificial (IA) baseados em redes neurais convolucionais podem ser usados para pontuar dados de ensaios de MN adquiridos por IFC. Este documento descreve todas as etapas para usar o software de IA para criar um modelo de aprendizado profundo para pontuar todos os eventos-chave e aplicar esse modelo para pontuar automaticamente dados adicionais. Os resultados do modelo de aprendizagem profunda de IA se comparam bem à microscopia manual, permitindo assim a pontuação totalmente automatizada do ensaio MN combinando IFC e IA.
Introdução
O ensaio de micronúcleos (NM) é fundamental na toxicologia genética para avaliar danos ao DNA no desenvolvimento de cosméticos, fármacos e produtos químicos para uso humano 1,2,3,4. Os micronúcleos são formados a partir de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos que não se incorporam ao núcleo após a divisão e se condensam em pequenos corpos circulares separados do núcleo. Assim, o NM pode ser usado como um desfecho para quantificar danos ao DNA em testes de genotoxicidade1.
O méto....
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Protocolo
1. Aquisição de dados por citometria de fluxo por imagem
NOTA: Consulte Rodrigues et al.16 com as seguintes modificações, observando que as regiões de aquisição usando IFC podem precisar ser modificadas para a captura ideal da imagem:
- Para o método não-Cyt-B, realizar uma contagem de células usando um contador de células disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) em cada cultura imediatamente antes da cultura e imediatamente após o período de recuperação.
- Se estiver executando amostras em um citômetro de fluxo de image....
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Resultados
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para usar o software de IA para criar um modelo para o ensaio MN. O usuário carrega os arquivos .daf desejados no software de IA e, em seguida, atribui objetos às classes de modelo verdade terrestre usando os algoritmos de marcação de cluster assistido por IA (Figura 2) e de previsão (Figura 3). Uma vez que todas as classes de modelo verdade terrestre tenham sido preenchidas com objetos suficien.......
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Discussão
O trabalho aqui apresentado descreve o uso de algoritmos de aprendizagem profunda para automatizar a pontuação do ensaio MN. Diversas publicações recentes têm demonstrado que ferramentas intuitivas e interativas permitem a criação de modelos de deep learning para analisar dados de imagens sem a necessidade de conhecimento computacional aprofundado18,19. O protocolo descrito neste trabalho usando um pacote de software orientado por interface de usuário foi projeta.......
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Divulgações
Os autores são empregados pela Luminex Corporation, uma empresa DiaSorin, fabricante do citômetro de fluxo de imagem ImageStream e do software Amnis AI usado neste trabalho.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Encha o recipiente com 200 mL de Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeFiltro | 64-86-8 | |
| MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µ m filtro, frasco de 500 mL | |
| Citocalasina B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | frasco de 5 mg |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Encha o recipiente com 200 mL de Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Grátis |
| Soro Fetal Bovino | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldeído, 10%, sem metanol, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | Isto é o que é usado para a formalina a 4% e 1%. CUIDADO: Formalina/Formaldeído tóxico por inalação e se ingerido. Irritante para os olhos, sistemas respiratórios e pele. Pode causar sensibilização por inalação ou contato com a pele. Risco de danos graves aos olhos. Risco potencial de câncer. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Analisador de células de musa de goiaba | Luminex | 0500-3115 | Foi utilizada uma configuração padrão Analisador de células de musa de goiaba. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solução |
| Manitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Aminoácidos Não Essenciais 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, uma empresa DiaSorin | 100220 | Foi utilizada uma câmera 2 ImageStreamX Mark II equipada com os lasers de 405 nm, 488 nm e 642 nm. |
| Software de análise MIFC - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" O software que acompanha o software MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Software MIFC - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" Este é o software que executa o software MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" Este é o software que permite a criação de modelos de inteligência artificial para analisar dados |
| Mitomicina C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| Mistura NEAA 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Solução de Penicllin/Estreptomicina/Glutamina 100X | Gibco | 15070063 | |
| Cloreto de Potássio (KCl) | Enxágue MilliporeSigma | P9541 | |
| - Água ultrapura ou água deionizada | NA | NA | Use qualquer água ultrapura ou água deionizada. Encha o recipiente com 900 mL de enxágue. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Médio 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Bainha - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | Este é o mesmo que o Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ grátis. Encha o recipiente com 900 mL de bainha. |
| Água estéril | HyClone | SH30529.01 | |
| Esterilizador - 0.4%– 0,7% de hipoclorito | VWR | JT9416-1 | Este é asseguravelmente 10% de alvejante Clorox que pode ser feito deluting de alvejante Clorox com água. Encha o recipiente com 200 mL de Sterilzer. |
| Frasco T25 | Falcon | 353109 | |
| Frasco T75 | Falcon | 353136 | |
| células TK6 | MilliporeSigma | 95111735 |
Referências
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....
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Reimpressões e permissões
