Artigo de método

Carrapato Alimentação por Membrana Artificial para Ixodes scapularis

DOI:

10.3791/64553

⸱

30 de novembro de 2022

 ,  , 
1Division of Environmental Health Sciences, School of Public Health, University of Minnesota, 2Department of Entomology, College of Food, Agricultural and Natural Resources, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentado aqui é um método para alimentar carrapatos no sangue in vitro através de um sistema de membrana artificial para permitir o ingurgitamento parcial ou total de uma variedade de estágios de vida do carrapato.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os carrapatos e suas doenças associadas são um importante tópico de estudo devido à sua saúde pública e carga veterinária. No entanto, as necessidades de alimentação dos carrapatos durante o estudo e a criação podem limitar as questões experimentais ou a capacidade dos laboratórios de pesquisar carrapatos e seus patógenos associados. Um sistema de alimentação por membrana artificial pode reduzir esses problemas e abrir novos caminhos de pesquisa que podem não ter sido possíveis com os sistemas tradicionais de alimentação animal. Este estudo descreve um sistema de alimentação por membrana artificial que foi refinado para o sucesso da alimentação e ingurgitamento para todos os estágios de vida de Ixodes escapulares . Além disso, o sistema de alimentação por membrana artificial descrito neste estudo pode ser modificado para uso com outras espécies de carrapatos através do simples refinamento da espessura de membrana desejada. Os benefícios de um sistema de alimentação por membrana artificial são contrabalançados pela intensidade do trabalho do sistema, os fatores ambientais adicionais que podem afetar o sucesso da alimentação e a necessidade de refinar a técnica para cada nova espécie e estágio de vida dos carrapatos.

Introdução

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As doenças transmitidas por carrapatos afetam fortemente a saúde de humanos e animais em todo o mundo, sendo responsáveis por mais de dois terços de todas as doenças associadas a vetores nos EUA de 2004 a 20161. Além disso, o número de casos vem crescendo nos últimos anos, com mais pessoas e gado sendo afetados por carrapatos e suas doenças associadas 2,3. Embora existam provavelmente inúmeras causas para a tendência ascendente no número de casos, a mudança climática é um fator importante 3,4. O aumento contínuo previsto no número de casos de doenças transmitidas por carrapatos sublinha a necessidade de desenvolver novas ferramentas para investigar as relações entre os carrapatos e os patógenos que eles transmitem.

Sabe-se que os carrapatos sofrem alterações na fisiologia e expressão gênica durante a alimentação e que essas alterações desempenham um papel na transmissão de patógenos 5,6. Pode ser difícil realizar estudos que examinem os efeitos da alimentação total e parcial na transmissão e aquisição de patógenos usando modelos animais, particularmente em situações em que os modelos de roedores não são suscetíveis à infecção por um patógeno específico. Por exemplo, a cepa Anaplasma phagocytophilum Variant-1 é transmitida naturalmente entre Ixodes scapularis e veados, mas é incapaz de infectar camundongos, complicando a infecção por carrapatos no laboratório7. Sistemas de alimentação artificial também podem ser aplicados para ajudar a estudar patógenos como Borrelia burgdorferi através do uso de mutantes transgênicos que apresentam deleções gênicas que inibem a transmissão ou infecção8. O uso de um sistema de alimentação artificial ajuda os pesquisadores a isolar o papel dos genes, permitindo que a infecção ou a transmissão ocorram apenas no lado do carrapato, isolando assim qualquer resposta do hospedeiro que possa confundir tais estudos.

Da mesma forma, alguns estágios da vida de carrapatos envolvidos em doenças e transmissão animal podem não ser induzidos a se alimentar de espécies comuns de modelo de laboratório. As fêmeas de Ixodes scapularis , por exemplo, devem ser alimentadas com animais maiores, tipicamente coelhos9. Embora muitas vezes acessíveis para experimentação em laboratório, os requisitos administrativos e de criação do uso de coelhos excedem os de pequenos roedores e podem ser proibitivos para alguns laboratórios. Outras espécies de carrapatos, particularmente as que suscitam preocupação veterinária, devem ser alimentadas com bovinos ou outros animais de grande porte que não sejam práticos de utilizar na maioria dos laboratórios. A alimentação in vitro e os métodos de infecção, como a alimentação artificial por membrana, fornecem alternativas ao uso de animais hospedeiros grandes ou exóticos.

Além disso, o uso de um sistema de alimentação artificial permite certas análises que podem não ser possíveis com os métodos tradicionais de alimentação animal. Um exemplo é que, ao separar a fonte de sangue do mecanismo de alimentação, torna-se possível o exame do papel que o sangue de diferentes hospedeiros pode ter na transmissão de B. burgdorferi 10. Esse exame do sangue do hospedeiro e do papel que o próprio sangue desempenha na ausência da resposta imune do hospedeiro é um fator importante para a compreensão dos ciclos de transmissão de patógenos e que os sistemas de alimentação artificial são capazes de ajudar a responder11. Também se torna possível quantificar os números exatos de transmissão de um patógeno durante uma alimentação, em vez de apenas examinar o sucesso da transmissão e o estabelecimento em um hospedeiro 8,12.

Algumas das primeiras membranas de alimentação artificial feitas para carrapatos duros foram feitas de peles de animais ou membranas derivadas de animais nas décadas de 1950 e 196013,14. Devido à natureza biológica dessas membranas, houve problemas com a produção de novas membranas e com a vida útil. Na década de 1990, foram desenvolvidas membranas totalmente artificiais que utilizavam um suporte de rede, papel ou tecido com impregnação de silicone15,16. O silicone era ideal, pois suas propriedades físicas imitam a elasticidade da pele e a ligeira aderência, juntamente com sua natureza bio-inerente. Com base nisso, Krober e Guerin, em cujo trabalho essa técnica se baseou, descreveram uma técnica de alimentação por membrana de rayon impregnada de silicone para a alimentação artificial de I. ricinus17.

O refinamento dos métodos para I. scapularis, uma espécie intimamente relacionada, levou a diferenças notáveis na dureza do silicone usado na impregnação da membrana, na receita para a produção de membrana, nas dimensões da câmara e no estimulante de fixação. Embora os refinamentos relatados neste estudo tenham resultado em características de membrana semelhantes às relatadas por Andrade et al., que também desenvolveram uma membrana à base de silicone à base de Krober e Guerin para uso em I. scapularis, há uma diferença nas etapas de impregnação do silicone, o que permite a flexibilidade de utilizar esse protocolo para estágios de vida imaturos de I. scapularis 15, 18. Este estudo também descreve adições e alterações técnicas com base no uso repetido desse método, melhores práticas que resultam em uma alimentação bem-sucedida e solução de problemas que possam surgir. Esse método tem sido utilizado para alimentar todos os estágios ativos da vida, infectar carrapatos com bactérias patogênicas e expor carrapatos a múltiplas dosagens de antibióticos19,20. Enquanto o método de alimentação por membrana artificial mostrado é para I. scapularis, este método é facilmente adaptável a outras espécies de carrapatos com pequenas modificações na espessura da membrana.

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Protocolo

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1. Preparação da câmara de membrana do carrapato

  1. Prepare uma superfície plana e não porosa, como um plano de vidro ou base metálica revestida de cerâmica de um suporte de braço, limpando-a com etanol a 70% e, em seguida, cubra-a com uma única camada de filme plástico, certificando-se de que o filme plástico é plano e sem bolhas ou rugas (ver Figura 1A).
  2. Tape 100% de papel de limpeza da lente rayon para a superfície preparada. Certifique-se de que está plano e ligeiramente tenso com fita adesiva em todos os quatro lados do papel. Dois pedaços de 4 em x 6 em papel de lente podem ser transformados em membranas usando os volumes descritos na etapa 1.3.
    NOTA: Isso é suficiente para compor até 12 câmaras de alimentação (ver Figura 1B). Se a membrana for para carrapatos larvares, use papel unryu em vez de papel de limpeza de lente.
  3. Prepare a mistura de silicone de dureza 00-10 medindo 5 mL de cada parte do kit de silicone em um recipiente descartável, misturando levemente os dois líquidos antes de adicionar 1,5 mL de hexano. Continue misturando até que a mistura esteja homogênea e completamente misturada.
    NOTA: Se estiver fazendo membranas para carrapatos adultos, use silicone de dureza 00-50.
  4. Use um rodo pequeno para distribuir a mistura de silicone sobre o papel da lente. Deixe repousar durante 1 min para garantir que o silicone tenha embebido no papel da lente. Raspe constantemente o excesso de silicone para o lado com o rodo usando uma pequena quantidade de pressão descendente. Execute uma segunda passagem com o rodo, sem exercer pressão para baixo, para remover quaisquer linhas de silicone e produzir uma camada lisa.
    NOTA: Esta etapa do procedimento pode exigir alguma prática para produzir membranas de espessura ideal para cada estágio de vida (adultos: 150-200 μm; ninfas: 90-120 μm; larvas: 80-100 μm). Uma membrana mais espessa (dentro das tolerâncias de alimentação do estágio de vida) geralmente produzirá melhores resultados, reduzindo a condensação na câmara e melhorando a característica de auto-cicatrização da membrana.
  5. Apenas para larvas, mergulhe o topo da câmara de alimentação em resina de fluoropolímero Fluon (PTFE-30) várias vezes, permitindo que ela seque entre as aplicações para produzir uma camada consistente.
    NOTA: A aplicação de Fluon formará uma camada antiaderente de resina de fluoropolímero semelhante a uma panela antiaderente. Isso reduzirá o número de larvas que sobem ao topo da câmara21.
  6. Deixe a membrana para curar por pelo menos 24 horas em um ambiente livre de poeira, como um armário químico ou de biossegurança fechado, antes de passar para a próxima etapa. Consulte a Figura 1C para saber como o papel da lente rayon fica depois que o silicone foi deixado secar.
  7. Prepare a mistura de silicone de 30 durezas para anexar as câmaras à membrana, misturando partes iguais da mistura de silicone A e B.
  8. Mergulhe as câmaras de policarbonato cerca de 6 mm (um quarto de polegada) na mistura de silicone e, em seguida, coloque na folha de membrana, tomando cuidado para não sobrepor nenhuma das fitas (Figura 1D).
  9. Deixe o silicone de fixação curar por pelo menos 24 horas antes de passar para os próximos passos.
  10. Usando um bisturi, corte cuidadosamente a membrana ao redor de cada uma das câmaras anexas, aparando as bordas para que ela possa se encaixar suavemente em um poço da placa de 6 poços sem muita raspagem nas laterais (Figura 1E). Deixe material suficiente fora da câmara para maximizar a adesão da membrana.
    NOTA: Se sobrar muito material exterior, a remoção repetida da câmara da placa de 6 poços pode fazer com que a membrana se desprenda parcialmente da câmara. A reparação de membranas descoladas é descrita na secção 5.
  11. Corte um pequeno pedaço da membrana que sobra de cada um dos cantos e do centro da folha de membrana. Retire o filme plástico de cada peça. Meça as peças com um micrômetro para determinar a espessura média da membrana.
    NOTA: Se a espessura da membrana não se enquadrar no intervalo de tolerância para a fase de vida (ver passo 1.4), as membranas devem ser eliminadas e refeitas. A espessura do papel Unryu é altamente variável devido aos seus fios espessos de fibra e regiões finas. Embora essa característica permita que as larvas encontrem regiões de espessura ideal, dificulta a determinação da espessura real da membrana.
  12. Colocar as câmaras de alimentação juntamente com um anel O por câmara num copo de vidro a autoclavar a 121 °C durante, pelo menos, 20 minutos para esterilizar. Deixe as câmaras esfriarem antes de usá-las.

2. Configurando o feed de carrapatos

  1. Prepare uma lâmpada ou sala para que as luzes fiquem acesas por 16 horas e depois apagadas por 8 horas. Se estiver usando uma lâmpada, certifique-se de que o banho-maria na próxima etapa esteja no escuro para aqueles 8 h.
  2. Configure um banho de água a 34 °C e com suportes para que uma placa de 6 poços possa sentar-se e flutuar ligeiramente nela. Use pequenos copos de vidro afundados no banho-maria como suportes. Use uma cobertura transparente para o banho-maria para manter um ciclo claro-escuro para os carrapatos; se necessário, use um suporte em T e um filme plástico para fazer uma capa. Para reduzir o risco de contaminação, adicione 0,02% de cloreto de benzalcónio ao banho-maria e coloque outro banho-maria a 36 °C para aquecer o sangue refrigerado.
  3. Retire as câmaras de membrana autoclavadas pré-preparadas, colocando o anel O ao redor da câmara (Figura 1F) e, em seguida, encha cada câmara com etanol suficiente a 70% para cobrir a membrana. Deixe descansar em um poço de placa de 6 poços por 5 minutos e, em seguida, procure por quaisquer vazamentos entre a câmara e a membrana e na própria membrana.
    NOTA: Se a membrana estiver vazando, o etanol se acumulará na base do poço. Membranas com vazamento devem ser descartadas.
  4. Esvazie o etanol das câmaras e, em seguida, deixe-o secar ao ar dentro de um gabinete de biossegurança ou exaustor de fluxo laminar.
    NOTA: Isso pode levar vários minutos, dependendo da umidade ambiente.
  5. Enquanto espera, o calor inativa o complemento no sangue aquecendo a 56 °C por 40 min. Suplementar sangue bovino desfibrinado mecanicamente com 2 g/L de glicose.
  6. Depois que a membrana estiver seca, aplique ~20 μL de fagostimulante no interior da câmara e, em seguida, espalhe-o ao redor da superfície, inclinando a câmara. Ver secção 6 para instruções relativas à preparação de um fagostimulante a partir de frass de carrapatos.
  7. Espere até que o fagostimulante esteja seco antes de adicionar os carrapatos à câmara com uma escova ou pinça. Trabalhe o mais rápido possível ao transferir os carrapatos para a câmara para evitar a fuga. Coloque os carrapatos em um tubo no gelo por 1-2 minutos antes de transferi-los para diminuir sua capacidade de escapar. Depois que os carrapatos tiverem sido transferidos, sele o topo com parafilme; não estique demais o parafilme, pois o calor do banho-maria pode fazer com que ele se rasgue.
    NOTA: O fórceps funciona melhor com os estágios da vida ninfal e adulta e os pincéis funcionam melhor com os estágios da vida larval.
  8. Adicionar 5 ml de sangue inactivado pelo calor por poço/câmara num tubo cónico e colocar no banho-maria regulado a 36 °C. Traga o sangue resfriado até pelo menos a temperatura ambiente antes de expor os carrapatos a ele. Reserve quatro câmaras por placa de 6 poços para facilitar o manuseio das câmaras. Mais câmaras por placa devem ser evitadas, no entanto, dependendo do tamanho do banho de água, mais placas podem ser usadas.
  9. Adicionar 5 μL de 3 mM de ATP e 50 μL de 100x de penicilina/estreptomicina/fungizona por 5 mL de sangue ao tubo.
  10. Transfira 4,5 mL de sangue para um poço de uma placa de 6 poços e, em seguida, coloque suavemente a câmara no poço, ajustando a altura do anel O na câmara para que a membrana fique no sangue, mas o nível sanguíneo ao redor do lado não sobrecarregue o poço. Coloque o poço no sangue em um ângulo para evitar a formação de bolhas de ar entre o sangue e a membrana.
    NOTA: Uma placa completa é mostrada na Figura 2.
  11. Coloque a tampa da placa de 6 poços em cima das câmaras de alimentação; em seguida, colocar a placa de 6 poços com câmaras no banho-maria preparado a 34 °C e fechar a tampa.
    NOTA: A tampa no topo ajudará a impedir que a água condensada entre em contato com o parafilme e dilua o sangue nos poços.

3. Manter os carrapatos de alimentação trocando o sangue a cada 12 h

  1. Aliquot 5 ml do sangue inactivado pelo calor por poço num tubo e aqueça-o num banho de água a 36 °C. Descongele o ATP e a penicilina/estreptomicina/fungizona no banho-maria ao mesmo tempo.
  2. Adicionar 5 μL de 3 mM de ATP e 50 μL de 100x de penicilina/estreptomicina/fungizona por poço ao tubo sanguíneo. Transfira 4,5 mL de sangue para um poço de uma placa fresca de 6 poços.
  3. Retire a placa de 6 poços com a câmara de carrapatos do banho de água. Retire a câmara do poço e lave o exterior da câmara e da membrana com 10 ml de PBS estéril 1x para remover o sangue.
  4. Usando papel de filtro autoclavado, seque suavemente a membrana e a câmara para remover o excesso de PBS. Substitua o parafilme na parte superior da câmara. Se houver muita condensação dentro da câmara, seque as manchas molhadas com papel de filtro autoclavado antes de selar com parafilme fresco.
  5. Coloque a câmara de carrapatos na nova placa de 6 poços com sangue fresco, ajustando a altura do O-ring, se necessário. Repita os passos 3.3-3.5 para cada câmara na placa. Coloque a tampa da placa de 6 poços sobre o topo das câmaras. Mova a nova placa de 6 poços de volta para o banho de água a 34 °C.
  6. Repita os passos 3.1-3.5 a cada 12 h até a conclusão da alimentação do carrapato. Espere que os carrapatos se despordem da membrana sozinhos quando ingurgitados ou remova-os suavemente da membrana com pinças de toque macio enquanto ainda estão presos para obter carrapatos parcialmente ingurgitados.

4. Tratamento antifúngico

NOTA: Execute somente quando o crescimento fúngico é visto na membrana. É provável que o fungo se forme no lado sanguíneo da membrana se a alimentação for de duração suficiente. A primeira indicação de contaminação fúngica é pequenos (1-3 mm) flocos de sangue coagulado visíveis na membrana. Quando a contaminação fúngica é observada, os tratamentos antifúngicos podem prolongar a duração do experimento e melhorar o sucesso do ingurgitamento.

  1. Dissolver 10.000 U de nistatina por mL em água destilada, 5 mL por câmara de alimentação. Filtrar-esterilizar com um filtro de seringa de 0,1 μm.
  2. Adicionar 5 mL de solução de nistatina por poço de uma nova placa de 6 poços, um poço para cada câmara de alimentação.
  3. Coloque as câmaras enxaguadas com PBS na solução. Deixe descansar por 10 min.
  4. Lave as membranas tratadas com PBS antes de voltar a colocar em sangue fresco.
  5. Repita o tratamento antifúngico a cada 2-3 dias (dependendo da extensão da contaminação fúngica) até a conclusão do experimento.

5. Readerindo membranas destacadas com cola de cianoacrilato

NOTA: Execute somente quando o descolamento da membrana for notado.

  1. As membranas podem se desprender parcialmente das câmaras de alimentação, especialmente durante a remoção da placa de 6 poços. Se isso acontecer, lave a membrana do sangue com PBS.
  2. Seque suavemente a área afetada. Não precisa estar perfeitamente seco, mas a presença de umidade faz com que a cola se ajuste mais rapidamente.
    NOTA: A readesão da membrana limita o tempo de trabalho, no entanto, dependendo do tamanho do descolamento, um tempo de ajuste mais rápido pode ser desejável.
  3. Esprema uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato na lacuna onde a membrana se afastou da câmara. Segure no lugar por ~2 min para permitir que a cola se ajuste.
  4. Coloque a câmara de volta no sangue na placa de 6 poços.

6. Fazendo phagostimulant

NOTA: Execute no final de uma alimentação ou antes de uma alimentação por membrana ter começado.

  1. Colete fezes de carrapatos de uma alimentação de membrana anterior ou de outra fonte de carrapatos de alimentação. Armazenar as fezes a -20 °C antes de fazer o fagostimulante. Esmague os pellets de fezes de carrapatos e misture 0,1 g por 1 mL de água. Adicione 1 mM de glutationa reduzida tripeptídica, dissolva e misture completamente por vórtice.
  2. Filtrar-esterilizar com um filtro de seringa de 0,1 μm.
  3. Congelar a -20 °C até ser necessário.

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Resultados

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Uma alimentação bem-sucedida depende se um ingurgitamento parcial ou total é desejado. Alimentado com sucesso I. scapularis virar um tom de cinza gunmetal para adultos e se desprender por conta própria da membrana. No entanto, se eles são pelo menos do tamanho de ervilha, eles podem ser separados da membrana ao terminar a alimentação. Para estágios imaturos de I. scapularis , o tamanho para carrapatos totalmente ingurgitados varia, e porque, ao contrário dos adultos, eles não exibem uma mudança de cor, ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A alimentação artificial por membrana de carrapatos fornece uma ferramenta útil para uma variedade de procedimentos experimentais, mas não é provável que substitua a alimentação animal para todas as aplicações. Manter grandes colônias de carrapatos em todos os estágios da vida sem alimentação animal é geralmente insustentável. Em vez disso, o sistema de alimentação artificial é valioso para outros fins, como infectar carrapatos com patógenos não suportados por hospedeiros modelo, avaliar os impactos de dosagens controlad...

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
00-10 Dureza SiliconeSmooth-OnEcoflex 00-10Tamanho de teste da Loja Smooth-On
00-50 Dureza SiliconeSmooth-OnEcoflex 00-50Tamanho de teste da Loja Smooth-On
30 Dureza SiliconeSmooth-OnMold Star 30Tamanho de teste da Loja Smooth-On
Placas de cultura de células de 6 poçosCorning Incorporated3516
Trifosfato de adenosina (ATP)Millipore SigmaA1852-1VLUsado para fazer uma solução aquosa de 3 mM ATP que foi filtrada esterilizada via filtro de 0,2 micômetro
Sangue bovinoHemoStatDBB500Mecanicamente desfibrinado; 500 mL é geralmente suficiente para um experimento
ClingwrapFisherbrand22-305654 
Papel de filtroFisherbrand09-790-2CAutoclave e deixe esfriar antes de usar. Pode usar qualidade fina em vez de média também
Fluon (politetrafluoretileno aquoso)Bioquip2871Disponível de outras fontes, como https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
GlicoseMillipore SigmaG8270-100G
HexanoMillipore Sigma139386-100ML
Papel para lentesFisherbrand11-995100% rayon
Nistatina  Gold BiotechnologyN-750-10
ParafilmFisherbrandS37440 
Penicilina/estreptomicina/fungizonaGibco15240-096Ou genérico equivalente com concentração como segue (10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 µ g/mL de estreptomicina e 25 µ g/mL de Anfotericina B)
FagoestimulanteFeito em CasaColetado de alimentações anteriores de carrapatos
Tubo de PolicarbonatoMcMaster-Carr8585K204 Corte em 45 mm de comprimento, 1,25 polegada de diâmetro externo, 1 polegada de diâmetro interno. O corte requer um rebolo de serra de corte.
Anéis de BorrachaMcMaster-Carr9452K38 5 mm de espessura, 1,25 pol de diâmetro interno
Pinça de toque suaveVWR470315-238 
Super colade cianoacrilato cola
Papel Unryu O material de arte armazenafibra de amoreira 10 g / m < sup>2< / sup>. Comprado na loja de materiais de arte Wet Paint, St. Paul, MN, EUA

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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