Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.
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Artigo de método
Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O músculo esquelético abriga populações distintas de células-tronco adultas que contribuem para a homeostase e reparo do tecido. As células-tronco musculares esqueléticas (MuSCs) têm a capacidade de produzir novos músculos, enquanto os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) contribuem para os tecidos de suporte estromais e têm a capacidade de produzir fibroblastos e adipócitos. Tanto MuSCs quanto FAPs residem em um estado de saída prolongada e reversível do ciclo celular, chamado quiescência. O estado quiescente é fundamental para sua função. As células-tronco quiescentes são comumente purificadas a partir de múltiplos tecidos musculares agrupados em uma única amostra. No entanto, estudos recentes têm revelado diferenças distintas nos perfis moleculares e na profundidade de quiescência de MuSCs isolados de diferentes músculos. O presente protocolo descreve o isolamento e estudo de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais e apresenta estratégias para realizar análise molecular da ativação de células-tronco. Ele detalha como isolar e digerir músculos de diferentes origens de desenvolvimento, espessuras e funções, como diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), gastrocnêmio (GA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL) e músculos masseteres. MuSCs e FAPs são purificados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e analisados por coloração de imunofluorescência e ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).
Introdução
O músculo esquelético tem uma alta capacidade de regeneração devido à presença de células-tronco musculares (MuSCs). As MuSCs localizam-se nas miofibras, abaixo da lâmina basal, e residem em estado quiescente de saída prolongada e reversível do ciclo celular 1,2,3,4. Após a lesão, as MuSCs ativam-se e entram no ciclo celular para dar origem a progenitores amplificadores que podem se diferenciar e fundir-se para formar novas miofibras 2,5. Trabalhos anteriores mostraram que as CTms sã....
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Protocolo
O presente protocolo foi realizado de acordo com as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Aarhus e regulamentos de ética locais.
NOTA: Certifique-se de cumprir os regulamentos do comitê de ética local para experimentação animal e manuseio de amostras post-mortem de roedores. Os ratos são uma fonte potencial de alérgenos; Se disponível, ligue a ventilação de exaustão e coloque-a sobre o espaço de trabalho para evitar a exposição excessiva a alérgenos. Alternativamente, use uma máscara facial se o experimento for realizado regularmente. Esse protocolo envolve o trabalho com materiais perfurocortantes, e recomenda-se que os pes....
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Resultados
Seguindo o protocolo de isolamento individual da musculatura esquelética (Figura 2), os músculos grácil, AT, EDL, GA, sóleo, tríceps, masseter e diafragma foram isolados de três camundongos machos suíços de raça outbre que haviam sido descontinuados de um programa de melhoramento local (Figura 2). Após dissociação tecidual e coloração de anticorpos, MuSCs e FAPs dos músculos individuais foram purificados por FACS (Figura 3). O gatin.......
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Discussão
Várias etapas são fundamentais na execução deste protocolo para alcançar bons rendimentos. Os músculos individuais têm um volume pequeno em comparação com a quantidade de músculo utilizada em protocolos de isolamento em massa. Isso resulta em um risco de o músculo secar durante a dissecção, o que reduz o rendimento. Para evitar isso, é importante adicionar meio aos músculos imediatamente após a dissecção. Além disso, se a dissecção estiver demorando mais, a pele pode ser removida de um membro de cada vez para reduzir o t.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes nem conflitos de interesse.
Agradecimentos
A triagem celular foi realizada no FACS Core Facility, Universidade de Aarhus, Dinamarca. As figuras foram criadas usando Biorender.com. Agradecemos ao Dr. J. Farup por compartilhar o anticorpo anti-PDGFRa do coelho. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção inicial da AUFF para E.P. e Start Package da NovoNordiskFonden para E.P. (0071113) e para A.D.M. (0071116).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de 1,5 mL (desempenho de PCR testado, PP, 30.000 xg, livre de DNA / DNase / RNase, baixa ligação ao DNA, estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A / S | 72.706.700 | Tubo de 1,5 mL |
| Tubo de 15 mL (PP / HD-PE, 20.000 xg, IVD / CE, IATA, DNA / DNase / RNase-free, Não citotóxico, livre de pirogênio, Estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A / S | 62.554.502 | Tubo |
| de 15 mLTubo de poliestireno de 5 mL com fundo redondo | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | Tubo FACS sem tampa de filtro |
| 5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo com tampa de filtro de célula | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | Tubo FACS com tampa do filtro |
| Tubo de 5 mL (PP, autoclavável não estéril) | Coleção VWR | 525.0946 | Tubo de 5 mL |
| Tubo de 50 mL( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, não citotóxico, livre de pirogênio, Estéril) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | Tubo de 50 mL |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Lote Thermo | Fisher: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 burro-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lote: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Instalação central Centrífuga da Universidade de Aarhus | |
| 5810 | eppendorf EP022628188 | Centrífuga | |
| Click-iT EdU Kit de Proliferação de Células para Imagem, Alexa Fluor 488 corante | Invitrogen, Thermo Fisher | Lote: 2387287 (Cat# C10337) | Kit de Proliferação |
| Celular Colágeno de pele de bezerro | Biorreagente, Sigma Aldrich | Fonte: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Colagenase tipo II | Worthington, Fisher Scientific | Lote: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lote: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Soro de burro (não estéril) | Sigma Aldrich, Merck | Lote: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Pinça reta com pontas finas |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Pinça curva |
| Mistura de nutrientes F-10 (Presunto) (1x), +L-glutamina | Gibco, Fisher Scientific | Lote. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Ácido acético glacial (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Rotador de mini-tubo cabeça a cabeça | Fisher Scientific | 15534080 (Modelo nº 88861052) | Rotador de mini-tubo cabeça sobre cabeça |
| Soro de cavalo | Gibco, Fisher Scientific | Lote. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Banho de água agitador |
| MS2 mini-shaker | IKA | Unidade de vórtice | |
| Agulha 20 G (0,9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | agulha 20G |
| Tampão de formalina neutro 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lote: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Filtro de células não pirogênicas (40 µ M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Filtro de células |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 anticorpo primário | DSHB | Lote: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x concentrado em pó | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Cat # 105720) | |
| Caneta/estreptococo | Gibco, Fisher Scientific | Lote. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Ponteiras de pipeta p10 | Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific | 2140-05 | Pontas de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras de filtro |
| Ponteiras de pipeta p1000 | Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific | 2279-05 | Ponteiras de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras de filtro |
| Ponteiras de pipeta p20 | Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific | 2149P-05 | Pontas de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras |
| pipeta p200 | Ponteiras artísticas, barreira auto-selante, Thermo Scientific | 2069-05 | Ponteiras de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, |
| Almofada protetora | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 camadas |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipetas (P10, P20, P200, P1000) |
| RabMAb anti-PDGFR-alfa recombinante | , abcam | AB134123 | |
| Bisturi (eixo nº 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Bisturi |
| Lâmina de bisturi nº 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Bisturi |
| Scanlaf mars | Labogene | gabinete de classe 2: Bancada Mars | Flow |
| Microscópio ScanR | Olympus | , Instalação central Tesoura da Universidade de Aarhus | |
| FST | 14568-09 | ||
| Série 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubadora |
| Pipeta sorológica 10 mL | VWR | 612-3700 | Pipeta sorológica estéril e não pirogênica |
| 5 mL | VWR, Avantor entregue pela VWR | 612-3702 | Seringa estéril, não pirogênica |
| 5 mL, ponta Luer (6%), estéril | BD Emerald, | Seringa | de 307731 |
| TC Dish 100, padrão | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Placa de Petri |
| Superfície tratada com cultura de tecidos (TC), poliestireno preto, fundo plano, estéril, tampa, pacote de 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | Placa de fundo de meio poço de 96 poços |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Fonte: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Referências
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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Reimpressões e permissões
