Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Resumo

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Resumo

As proteínas priônicas anormais (PrP^Sc) são a isoforma associada à doença da proteína priônica celular e marcadores diagnósticos de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). Estas doenças neurodegenerativas afectam os seres humanos e várias espécies animais e incluem o tremor epizoótico, a encefalopatia espongiforme bovina zoonótica (EEB), a doença crónica dos cervídeos (CWD) e a recém-identificada doença do prião dos camelos (DPC). O diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção de^{PrP Sc} pela aplicação dos métodos de imunohistoquímica (IHQ) e imunoblot ocidental (WB) em tecidos encéfalos, ou seja, o tronco cerebral (nível obex). A imunoistoquímica é um método amplamente utilizado que utiliza anticorpos primários (monoclonais ou policlonais) contra antígenos de interesse em células de um corte tecidual. A ligação anticorpo-antígeno pode ser visualizada por uma reação de cor que permanece localizada na área do tecido ou célula onde o anticorpo foi alvo. Assim, nas doenças priônicas, como em outros campos de pesquisa, as técnicas de imuno-histoquímica não são utilizadas apenas para fins diagnósticos, mas também em estudos de patogênese. Tais estudos envolvem a detecção dos padrões e tipos de^{PrP Sc} a partir daqueles descritos anteriormente para identificar as novas cepas de príons. Uma vez que a EEB pode infectar seres humanos, recomenda-se que sejam utilizadas instalações e/ou práticas de laboratório de biossegurança nível 3 (BSL-3) para manusear bovinos, pequenos ruminantes e amostras de cervídeos incluídas na vigilância das EET. Além disso, recomendam-se, sempre que possível, equipamentos de contenção e dedicados a príons para limitar a contaminação. O procedimento de IHQ^{PrP Sc} consiste em uma etapa de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico também atuando como uma medida de inativação do príon, uma vez que os tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina usados nesta técnica permanecem infecciosos. Ao interpretar os resultados, deve-se ter cuidado para distinguir a imunomarcação não específica da rotulação alvo. Para esse propósito, é importante reconhecer artefatos de imunomarcação obtidos em animais controles conhecidos negativos para EET para diferenciá-los de tipos específicos de imunomarcação^{PrP Sc} , que podem variar entre cepas de EET, espécie hospedeira e genótipo prnp , descritos mais detalhadamente neste artigo.

Introdução

De acordo com a hipótese do príon, a isoforma anormal (^{PrP Sc}) é o componente primário, ou único, do agente infeccioso nas encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). A confirmação para o diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção de^{PrP Sc} por meio da aplicação de protocolos de imunohistoquímica (IHQ) e/ou métodos de immunoblot ocidental (WB) de tecidos encéfalos¹.

A imunoistoquímica é um método que emprega anticorpos monoclonais ou, em alguns casos, policlonais (como anticorpos primários) como primeiro passo na imunomarcação de antígenos especificamente direcionados de interesse local....

Protocolo

O procedimento IHC aqui descrito é um componente do projeto de pesquisa FAIRJ-CT98-7021, "O estabelecimento de uma rede europeia para a vigilância de EET de ruminantes e a padronização e harmonização do processo e critérios para a identificação de casos suspeitos". Segue os critérios diagnósticos definidos pela Organização Mundial de Saúde Animal, WOAH (anteriormente denominado Office International des Épizooties, OIE)¹ e Laboratório Europeu de Referência para EET em^animais8,11. O procedimento IHC descrito também é acreditado de acordo com NPISOIEC17025 (requisitos gerais para a competê....

Resultados

Dado que a imunomarcação alvo não específica é possível, é importante determinar o nível de imunomarcação inespecífica em animais controles conhecidos negativos para EET. Esse é um passo importante para interpretar adequadamente a imunomarcação específica para^{PrP Sc7} (Figura 2). Observou-se que a marcação não-alvo por anticorpos anti-PrP ocorre como discreta coloração intraneuronal de partículas finas (mais evidente no núcleo do hipoglosso e no nú.......

Discussão

As EET são doenças zoonóticas potenciais. Após o surgimento da BSE em 1986 no Reino Unido, Portugal tornou-se um dos Estados-Membros da União Europeia com maior incidência desta doença^14,15. Para controlar esta doença, surgiram outras EET (tremor epizoótico clássico e atípico, variantes da EEB e, atualmente, a vigilância da doença crónica emaciante nos cervídeos), foram desenvolvidos mecanismos de vigilância pela Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV) .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010	Sem Uso
			Diluído a 90%, 70% e 50% em água destilada
Complexo Avidina-biotina e peroxidase Kit Vectastain Elite ABC Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare e misture delicadamente 30 min antes de usar de acordo com as instruções do kit. Não misture depois de repousar.
Anticorpo secundário biotinilado (Cavalo anti-camundongo IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Diluir a 1/200 em TBS com 10% de soro normal de cavalo. Prepare o volume necessário dependendo do número de seções.
Diaminobenzidina Cromógena- DAB, kit de substrato, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare antes de usar de acordo com as instruções do kit. Use 400 µ L de solução por secção.
Câmara de pressão DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Ehrlich' s Hematoxilina:
Hematoxilina	Merck	115938	Dissolva 2 g de hematoxilina em 100 mL de etanol absoluto. Adicione 100 mL de água destilada, 10 mL de ácido acético glacial e 15 g de alúmen de potássio com agitação constante. Adicione 100 mL de glicerina. O processo de oxidação natural leva 2 meses, antes do uso.
Etanol absoluto	Labchem	LB0507-9010
Ácido acético glacial	Merck	101830
Alúmen de potássio	Merck	1.01047.1000
Glicerina	Merck	1.04091.1000
Solução de bloco de peroxidase endógena (concentração de 3% H2O2):			40 mL Peróxido de hidrogênio (30% p/p) em 360 mL de metanol. Preparar antes
de usar Peróxido de hidrogênio (30% p/p)	Scharlau	HI0136
Metanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Ácido fórmico 98%	Merck	1.00264.1000	Microtomo não diluído
	Shandon-AS325	Microtomo	Shandon-AS325
Meio de montagem Entellan	Merck	107960	Pronto para uso.
Solução de bloco de soro normal (20%) em TBS: Soro normal de cavalo	Gibco	16050-122	Preparar o volume final de acordo com o número de seções no ensaio (200 µ L de solução por seção).
Anticorpo primário anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovinos incluindo scrapie atípico, cervina, felino. Não é adequado para bovinos. De acordo com o número de seções no ensaio (200 µ L de solução por seção) e diluição de anticorpos, preparar o volume final em TBS suplementado com 10% de soro normal da espécie em que o anticorpo secundário foi criado (soro normal de cavalo) Diluição usual de anticorpos: MAb 2G11 1/100, mas a diluição de trabalho deve ser estabelecida em cada novo lote para obter a concentração para dar a rotulagem mais forte com o fundo mais baixo. Para armazenamento, congelar volumes de alíquotas de no mínimo 10 μ L em microtubos estéreis. Descongele e use uma alíquota de cada vez.
Anticorpo primário anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Companhia Química	189710	PrP142-160 Bovinos, não adequados para ovinos Diluição usual de anticorpos: 1/200, mas a diluição de trabalho também deve ser estabelecida. Prepare como MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific
Shandon Sequenza® Centro de Imunização	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Suporte para lâminas de imunização	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g de citrato trissódico di-hidratado e 0.255 g de ácido cítrico em um litro de água purificada. Ajuste o pH da solução de trabalho para 6.1 usando solução de ácido cítrico 10 mM (1.05 g de ácido cítrico em 500 mL de água purificada) Prepare no dia do ensaio.
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma-aldrich	S4641-500G
Ácido cítrico	Sigma Aldrich	C0759
Frasco e cesta de coloração	Deltalab	19360
		19361
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	VWR	631-0108
Solução salina tamponada com tris (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0,8% NaCl; pH 7,6):			10xTBS (solução reserva 0,5 M TRIZMA BASE; 8% NaCl; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g e NaCl 80 g em 800 mL de água purificada. Ajuste o pH da solução estoque usando ácido clorídrico 37% e o volume final para um litro com água purificada (mantenha 5± 3 ° C até 2 meses) Diluir a solução estoque de TBS 1/10 no dia do ensaio.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloreto de Sódio (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Reagentes Panreac Applied Chem ITW	251769	não diluídos

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