Cultura, congelamento, processamento e imagem de organoides e esferoides inteiros ainda em um hidrogel

O futuro da pesquisa e terapia celular está nas culturas de células 3D ^1,2,3. Os modelos organoides e esferoides fecham a lacuna entre os experimentos in vitro e os modelos animais, criando melhores modelos que imitam o desenvolvimento, a fisiologia e as doenças do corpo humano 4,5,6,7,8,9. No entanto, a reprodutibilidade e repetibilidade desses modelos permanecem desafiadoras. Além disso, o manuseio, a colheita, a transferência e a centrifugação dessas estruturas com as tecnologias atuais resultam em perda ou dano dos organoides e esferoides em muitas condições, afetando significativamente os resultados.

Apesar de muitos protocolos de coloração histológica, coloração imuno-histoquímica, marcação por imunofluorescência e criopreservação, não existe uma abordagem universal relacionada à padronização de condições experimentais, manuseio e processamento dessas estruturas delicadas sem perdê-las ou danificá-las. Os protocolos atuais também são incrivelmente longos, alternando de alguns dias a várias semanas, e incluem procedimentos complexos com vários reagentes 10,11,12,13,14. Além disso, a colheita, pipetagem, centrifugação e transferência de estruturas de crescimento 3D entre vasos de cultura celular e criovianos causam mudanças no posicionamento das estruturas e forças mecânicas e, finalmente, afetam a diferenciação e maturação dos organoides e esferoides. Tem sido relatado que a topologia tecidual, o posicionamento das células e as forças mecânicas impactam significativamente a diferenciação e maturação celular 6,15,16,17.

Portanto, é desejável melhorar as tecnologias convencionais atuais para gerar organoides e esferoides com qualidade estável. Um método/dispositivo que pule a centrifugação e outras etapas descritas acima e forneça o material em um único ambiente seguro do início ao fim dos múltiplos processos seria benéfico para alcançar os dados mais consistentes e confiáveis. Além disso, isso reduzirá as restrições de tempo, mão de obra e custo.

O dispositivo multiuso (MD) descrito aqui fornece um único ambiente seguro para múltiplos processos de organoides e esferoides (Figura 1 Suplementar). Este dispositivo e protocolos complementares eliminam as etapas de colheita, pipetagem, transferência e centrifugação. Os organoides e esferoides permanecem em seu ambiente in vitro durante os processos sequenciais. Este ambiente compreende principalmente componentes de matriz extracelular naturais ou sintéticas, como hidrogéis comercialmente disponíveis. Em outras palavras, os métodos descritos aqui permitem que uma amostra inteira de organoides / esferoides seja processada, examinada e congelada enquanto ainda está em uma gota de hidrogel.

O dispositivo biocompatível é resistente a temperaturas entre 60 °C e -160 °C, o que torna viável restaurar os organoides/esteroides em um tanque de nitrogênio líquido a -160 °C ou preparar blocos de resina para microscopia eletrônica a 60 °C. O nicho no dispositivo foi projetado para definir um espaço limitado para estruturas de crescimento 3D e estimular a formação de esferoides ou organoides com base nos estudos anteriores 18,19,20,21,22,23. Essa parte do dispositivo é transparente e contém um plástico específico que fornece alta qualidade óptica (índice de refração: 1,43; valor de abbe: 58; espessura: 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). Tanto o nicho quanto a parte "lateral" circundante causam autofluorescência. O nicho transparente no centro tem uma área de 80 mm 2, enquanto a parte lateral é de 600 mm². A profundidade do recipiente é de 15 mm e a espessura é de 1,5 mm. Essas características, além do tamanho e do design do dispositivo, possibilitam a realização de observações sob diferentes tipos de microscópio de alta tecnologia e o preparo das amostras para exames microscópicos eletrônicos (Figura 2). O sistema de fechamento do dispositivo fornece duas posições, uma selada no freezer e outra permitindo o fluxo de gás na incubadora. Os ensaios de proliferação e citotoxicidade da CCK8 demonstram efeitos semelhantes nas células em comparação com os pratos tradicionais de cultura celular (Figura 2 Suplementar). O teste de exclusão do azul de tripano demonstra alta viabilidade celular (94%) durante a cultura celular no DM (Figura 3).

Os processos que podem ser realizados para uma amostra no único dispositivo compreendem (1) cultura, (2) coloração histológica, (3) imunocoloração, incluindo marcação imuno-histoquímica e de imunofluorescência, (4) congelamento, (5) descongelamento, (6) exame sob microscópios ópticos, como microscópios ópticos, como microscópios de campo claro, campo escuro, fluorescência, confocal e super-resolução, (7) revestimento e exame diretamente sob um microscópio eletrônico de varredura, ou (8) preparação para microscopia eletrônica de transmissão ( Figura 2).

Existem diferentes metodologias para coloração histológica, marcação imuno-histoquímica ou marcação fluorescente de organoides e esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Colhê-los do hidrogel é o primeiro e principal passo da tecnologia atual. Após esta etapa, alguns métodos permitem a imunomarcação de montagem completa. Os organoides colhidos são incorporados em parafina, seccionados e rotulados para coloração e imunocoloração em outros. No entanto, as seções podem não apresentar toda a amostra e fornecer apenas dados limitados relacionados à arquitetura 3D da estrutura. Além disso, danos a essas estruturas 3D e perda de antigenicidade são efeitos colaterais bem conhecidos dessas tecnologias.

Os novos protocolos complementares para exames microscópicos neste artigo permitem uma análise de amostras inteiras ainda em hidrogel. Os protocolos aqui descritos incluem duas formulações recém-desenvolvidas: solução para imuno-histoquímica (S-IHC) e solução para marcação por imunofluorescência (S-IF). Os métodos com essas soluções permitem que os pesquisadores obtenham dados mais precisos, uma vez que não há efeitos nocivos dos fluxos de trabalho tradicionais, como centrifugação, pipetagem e transferência das estruturas delicadas. O protocolo descrito aqui também elimina a necessidade de etapas de colheita, bloqueio, limpeza e recuperação de antígenos, e encurta todo o procedimento para 6-8 h. Além disso, a metodologia permite adicionar simultaneamente de um a três anticorpos ao mesmo S-IF. Portanto, é possível obter os resultados no mesmo dia mesmo após os múltiplos experimentos de rotulagem, o que é outra vantagem do protocolo descrito aqui; Os protocolos tradicionais de marcação por imunofluorescência de montagem completa geralmente levam entre 3 dias e várias semanas 10,11,12,13,14.

A incorporação de parafina, outra etapa prejudicial que reduz a antigenicidade, também é omitida. A estrutura 3D permanece em seu ambiente in vitro do início ao fim do exame microscópico. Como a estrutura 3D permanece em suas condições de crescimento, os dados de expressão e localização de proteínas imitam melhor as condições in vivo. Resultados mais precisos são esperados, uma vez que a metodologia elimina as etapas que afetam a expressão do antígeno da amostra. A Tabela 1 e a Tabela 2 demonstram como esses novos protocolos eliminam etapas, economizam tempo e mão de obra no laboratório e reduzem custos e desperdício de produtos em comparação com os fluxos de trabalho tradicionais.

Além das etapas cruciais descritas acima, outro problema é fornecer um meio e método de criopreservação para preservar a estrutura 3D da amostra com maiores taxas de viabilidade celular 26,27,28,29,30,31. A criopreservação é essencial para a criação de um sistema modelo estável e para viabilizar o biobanco de organoides e esferoides^32,33. O biobanco de toda a estrutura 3D original permitirá uma recapitulação mais fiel do estado natural de saúde ou doença. As principais considerações são a conveniência e a confiabilidade da criopreservação e o descongelamento de organoides/esferoides. A recuperação de organoides pós-descongelamento é muito baixa na maioria das tecnologias atuais, muitas vezes inferior a 50%. No entanto, estudos recentes têm mostrado resultados promissores com melhora das taxas de sobrevida^26,27,28,29. Lee et al. demonstraram que 78% das células esferoides sobreviveram após a criopreservação quando utilizaram a solução da Universidade de Wisconsin contendo 15% de DMSO²⁸. A razão de sobrevida celular aumentou para 83% no estudo de Arai et ^al.29. No entanto, os resultados após a criopreservação são significativamente afetados, uma vez que as estruturas 3D não podem manter as mesmas características e qualidade. Além disso, os reagentes sem soro são necessários para as boas práticas de fabricação em ambientes farmacêuticos e de diagnóstico. Os fluxos de trabalho tradicionais usam um meio contendo soro fetal bovino (FBS) e dimetilsulfóxido (DMSO) para o método de congelamento lento, ambos associados a desvantagens. FBS é um produto derivado de animais e pode ter variações de lote. O DMSO é um crioprotetor muito bem-sucedido, mas a exposição a longo prazo, especialmente durante o descongelamento, pode causar efeitos citotóxicos^30,31.

Este artigo também descreve a metodologia de congelamento/descongelamento de organoides inteiros ou esferoides ainda em um hidrogel. Duas fórmulas para congelamento de organoides e esferoides são utilizadas no estudo: (1) DMSO a 10% contendo solução de congelamento tradicional (FS) e (2) um meio de criopreservação sem soro e DMSO. Este meio de criopreservação contém componentes da matriz extracelular, que são diferentes das fórmulas atuais. A matriz extracelular compreende duas classes principais de macromoléculas, proteoglicanos e proteínas fibrosas, que são essenciais para o andaime físico para os constituintes celulares, mas também iniciam processos necessários para a morfogênese, diferenciação e homeostase tecidual 34,35,36,37,38,39,40 . Os colágenos proporcionam resistência à tração, regulam a adesão celular, suportam a quimiotaxia e a migração e o desenvolvimento direto dos tecidos³⁷. Além disso, as fibras de elastina fornecem recuo aos tecidos que sofrem alongamento repetido³⁸. Uma terceira proteína fibrosa, a fibronectina, direciona a organização da matriz extracelular intersticial e tem papel crucial na mediação da fixação celular e funciona como um mecano-regulador extracelular³⁹. Du et al. demonstraram o efeito crioprotetor do hidrolisado de colágeno de frango sobre o sistema modelo de actomiosina natural⁴¹. Seus resultados sugerem que o hidrolisado de colágeno pode inibir o crescimento de cristais de gelo, reduzir a desnaturação e oxidação por congelamento de proteínas de forma semelhante aos crioprotetores comerciais e fornecer uma melhor estrutura de gel após os ciclos de congelamento-descongelamento. Portanto, a adição de componentes da matriz extracelular ao meio de criopreservação fornece um ambiente mais seguro e protetor para a amostra e suporta as estruturas vivas para curar após o congelamento-descongelamento.

Além disso, o presente estudo descreve um protocolo simples para marcar membranas citoplasmáticas e núcleos de organoides e esferoides vivos enquanto ainda estão no hidrogel.

1. Cultivo de organoides e esferoides

1. Coloque o hidrogel no gelo durante a noite (em uma geladeira ou em uma câmara fria) para descongelar.
2. Coloque o dispositivo multiuso comercialmente disponível (MD; ver Tabela de Materiais) na incubadora 1 dia antes do experimento (37 °C, 5% de CO₂) para aquecer.
3. Coloque as pontas estéreis da pipeta de extremidade larga no frigorífico a 4 °C.
   NOTA: As etapas 1.1-1.3 devem ser executadas no Dia 0 e as etapas 1.4-1.11 devem ser executadas no Dia 1.
4. Coloque o hidrogel no gelo em um exaustor de fluxo laminar por 15 min.
   1. Opcional: Diluir o hidrogel em meio de cultura de células frias de acordo com a recomendação do fabricante.
5. Coloque o tubo contendo um pellet de células HepG2 (linhagem celular de carcinoma hepatocelular obtida comercialmente; ver Tabela de Materiais) no gelo.
6. Placa 30-35 μL de hidrogel 100% dentro do nicho do dispositivo pré-aquecido para criar uma gota de gel.
7. Colocar 10.000 células HepG2 no meio do topo de cada gota de hidrogel (Figura 2) e incubar por 15 min a 37 °C.
8. Cubra a gota de hidrogel com 200 μL de Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco com 10% de Soro Fetal Bovino.
9. Cubra a tampa do MD na posição correta para permitir o fluxo de gás e coloque o dispositivo na incubadora.
10. Alimente as células com 200 μL de DMEM com 10% de FBS a cada dois dias.
11. Verifique o crescimento dos esferoides sob microscópio invertido (Figura 3). A formação de esferoides começa após o^3º dia. O vídeo 1 mostra a localização de esferoides em diferentes níveis em uma cúpula de hidrogel.
    NOTAS: É altamente recomendável aspirar suavemente o líquido ao redor do hidrogel e adicionar lentamente o novo líquido ao ambiente para evitar danificar as gotas de hidrogel.

2. Coloração de hematoxilina e eosina de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

1. Aqueça o fixador (4% paraformaldeído; PFA), PBS e hematoxilina (ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
2. Aspirar o meio que envolve a gota de hidrogel com uma pipeta, adicionar 100-200 μL de PFA a 4% para fixar e incubar durante 15-20 min a 37 °C.
3. Aspirar o PFA a 4% e adicionar 200 μL de PBS para lavar 3x durante 5 min cada a 37 °C. Em seguida, aspirar o PBS e incubar com 200 μL de solução de hematoxilina por 15-20 min a 37 °C.
4. Aspirar a hematoxilina e adicionar 200 μL de dH₂O para lavar 3x durante 10 min cada a 37 °C. Aspirar o dH₂O e incubar com 200 μL de etanol durante 5-10 min a 37 °C.
5. Aspirar o etanol e incubar com 200 μL de eosina (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 37 °C. Aspirar a eosina e adicionar 200 μL de dH₂O para lavar durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
6. Aspirar o dH₂O e adicionar 100 μL de glicerol para cobrir a gota de hidrogel como meio de montagem.
7. Opcional: Monte o nicho com uma tampa. Esta etapa pode ser omitida para evitar a compressão de organoides/esferoides de tamanho considerável.
8. Feche a tampa do MD com firmeza para evitar a secagem até o exame. A amostra é estável para exame por pelo menos 6 meses.

3. Imuno-histoquímica de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

1. Aquecer a solução para imuno-histoquímica obtida comercialmente (S-IHC; ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
2. Incubar os organoides ou esferoides no hidrogel com peróxido de hidrogénio a 3% (H 2 O 2) em 200 μL de dH₂O durante 5min a 37 °C.
3. Aspirar a solução de peróxido de hidrogénio e lavar em dH₂O durante 5 min a 37 °C. Aspirar o dH₂O e incubar duas vezes com 100 μL de S-IHC a 37 °C durante 10 min cada.
4. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) diluído em S-IHC durante 1-2 h a 37 °C (seguindo as recomendações do fabricante em matéria de diluição de trabalho).
5. Aspirar a solução de anticorpos primários e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C.
6. Aspirar 100 μL de S-IHC e incubar com um anticorpo secundário biotinilado (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C.
7. Aspirar a solução de anticorpos secundários e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de peroxidase de rábano (HRP) marcada com estreptavidina (ver Tabela de Materiais) durante 10 minutos a 37 °C.
8. Aspirar a PCR marcada com estreptavidina e incubar com 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada a 37 °C.
9. Aspirar o S-IHC e incubar com 100 μL de mistura de solução cromogénica DAB/AEC (ver Tabela de Materiais) durante 5-10 min a 37 °C.
10. Monitore a intensidade da coloração sob um microscópio de luz.
11. Lave com dH 2 O 3x por₂min cada.
12. Opcional: Incubar com 100 μL de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) para contracoloração nuclear durante 5 min a 37 °C.
13. Aspirar a hematoxilina e lavar em dH₂O durante 5 min.
14. Aspirar o dH₂O e cobrir a gota de hidrogel com 100 μL de glicerol como meio de montagem.
15. Feche a tampa do MD firmemente até o exame microscópico.
    NOTAS: As etapas de recuperação de antígenos e bloqueio de proteínas são omitidas neste protocolo, uma vez que o S-IHC elimina essas etapas.

4. Marcação por imunofluorescência de organoides/esferoides de montagem inteira em um hidrogel

1. Aqueça os seguintes materiais a 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, solução de anticorpos primários em S-IF, solução de anticorpos secundários em S-IF, coloração nuclear e glicerol (ver Tabela de Materiais).
2. Aspirar o meio de cultura celular e fixar com 200 μL de PFA a 4% durante 15-30 min a 37 °C. Aspirar o fixador e lavar em S-IF 3x durante 10 min cada a 37 °C.
3. Adicione dH₂O ao lado ao redor do nicho para fornecer umidade durante as etapas seguintes.
4. Aspirar o S-IF em torno da gota de hidrogel e incubar a gota de hidrogel com 100 μL de solução de anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) em S-IF durante 30-60 min a 37 °C.
5. Aspirar a solução de anticorpos primários e lavar em S-IF 3x durante 10 min cada a 37 °C.
6. Aspirar o S-IF e incubar com 100 μL de solução de anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais) em S-IF durante 30-60 min a 37 °C no escuro.
7. Aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar com PBS 3x durante 10 minutos cada um a 37 °C no escuro.
8. Aspirar o PBS e incubar com 100 μL de coloração de ADN nuclear contendo meio de montagem ou glicerol a 37 °C no escuro.
9. Preencha o nicho com glicerol para evitar a secagem.
10. Opcional: Cubra o nicho com uma folha de cobertura. Este passo pode ser omitido para evitar espremer os organoides/esferoides.
11. Feche bem o MD. As amostras em MDs podem ser armazenadas a 4 °C no escuro por pelo menos 6 meses com perda mínima de fluorescência.
12. Use as seguintes configurações para exame microscópico confocal: defina o valor do orifício de todos os canais como 20,1, mantenha a constante mestre de ganho em 550 para 488 nm, 485 para 550 nm e 450 para 594 nm, mantenha a potência do laser constante para todos os experimentos e a menor porcentagem em 2,0.
    NOTAS: Anticorpos primários: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumina (1:50), Anti-Beta-Galactosidase (1:25), Anticorpo Antimitocondrial (1:100), Anticorpo Anti-Golgi (1:50), Anti-Citoqueratina 5 (1:100), Anticorpo Ov6 (1:100). Anticorpos secundários: IgG anti-Coelho de Cabra (H+L)- 488, IgG de Cabra anti-Coelho (H+L)-550, IgG de Cabra anti-Rato (H+L)-488, IgG de Cabra anti-Rato (H+L)-550, IgY anti-Galinha de Cabra (H+L)-647. A diluição para todos os anticorpos secundários é de 1:100. Além disso, FITC-Faloidina (1:100), um anticorpo conjugado, também é usado (ver Tabela de Materiais).

5. Marcação da membrana plasmática e do núcleo de organoides e esferoides vivos em um hidrogel

1. Preparar a solução de rotulagem contendo aglutinina de gérmen de trigo Alexa fluor (5,0 μg/ml) e Hoechst (2 μM) na solução salina equilibrada de Hank (HBSS), de acordo com as recomendações do fabricante (ver Tabela de Materiais), e aquecer até 37 °C.
2. Aspirar o meio de cultura celular e adicionar 100 μL de solução de marcação para cobrir a gota de hidrogel. Incubar durante 15-30 min a 37 °C.
3. Retirar a solução de rotulagem e lavar duas vezes em PBS 2x durante 10 min cada a 37 °C. Opcional: Fixar com 200 μL de formaldeído a 4% durante 15 min a 37 °C.
4. Cubra a gota de hidrogel com glicerol como meio de montagem. Opcional: Monte o nicho com um vidro de cobertura.
5. Feche bem a tampa do MD e mantenha-o refrigerado no escuro até o exame microscópico de fluorescência/confocal. É estável por pelo menos 6 meses.

6. Congelamento e descongelamento de organoides/esferoides inteiros num hidrogel

1. Congele os organoides seguindo os passos abaixo.
   1. Aquecer a solução de congelação obtida comercialmente (FS; ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
   2. Aspirar o meio de cultura celular em torno da cúpula de hidrogel suavemente.
   3. Adicione 200 μL de FS suavemente. Incubar a amostra com FS a 37 °C durante 1 h.
   4. Feche bem a tampa do dispositivo e coloque-a em uma caixa de espuma. Coloque esta caixa de espuma noutra caixa de espuma, como mostra a Figura 3 suplementar. Feche ambas as caixas de espuma com força. Duas caixas de espuma dentro uma da outra fornecem uma faixa de gradiente de resfriamento de temperatura de 1 a 2 ° C / min da amostra em um freezer de -20 ° C.
   5. Colocar a caixa a -20 °C durante 2 h. Transfira a caixa para um congelador a -80 °C e deixe-a durante a noite.
   6. Retire a amostra das caixas. A amostra no MD pode ser mantida no congelador a -80 °C durante 6 meses.
   7. Transfira o MD que contém a amostra para o tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
2. Descongele os organoides seguindo os passos abaixo.
   1. Retire o MD que contém a amostra do congelador/reservatório de azoto e coloque-o directamente numa incubadora a 37 °C. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Adicionar 200 μL de meio de cultura quente ao nicho (a proporção de FS para meio de cultura celular é de 1:1) e incubar por 30 min a 37 °C.
   3. Adicionar mais meio de cultura quente ao nicho (a proporção de FS para o meio de cultura celular é de 1:2) e incubar por 30 min a 37 °C.
   4. Aspirar suavemente a mistura média e FS. Prossiga para a microscopia eletrônica de varredura (etapa 7) e microscopia eletrônica de transmissão (etapa 8) imagens dos organoides/esferoides de montagem inteira no hidrogel.

7. Microscopia eletrônica de varredura de organoides/esferoides de montagem inteira

1. Aqueça a solução fixadora e pós-fixadora de Karnovsky (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente (RT).
2. Aspirar o meio de cultura celular em torno do hidrogel no MD. Colocar a amostra no MD sobre gelo no exaustor de fluxo laminar por 15 min.
3. Aspirar o hidrogel liquefeito em torno dos organoides/esferoides muito suavemente. Uma quantidade limitada de matrigel pode permanecer no nicho para evitar danificar e perder a amostra.
4. Fixe com o fixador de Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,15 M e 2 mM CaCl₂; ver Tabela de Materiais) em RT por 1 h.
5. Aspirar o fixador suavemente e lavar com água destilada (dH₂O) 3x durante 15 min cada.
6. Aspirar o dH₂O suavemente e fixar com solução pós-fixadora (tetróxido de ósmio aquoso a 1% [OsO₄]; ver Tabela de Materiais) em RT durante 1 h.
7. Aspirar o pós-fixador suavemente e lavar com água destilada (dH₂O) 3x durante 15 min cada.
8. Desidratar em uma série graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mistura de etanol/acetona (1:1; 1:2) e acetona absoluta no RT por 15 min cada.
9. Seque com um secador de ponto crítico.
10. Revestir o provete no dispositivo com 6 nm de ouro/paládio utilizando um revestidor de esguicho (ver Tabela de Materiais) durante 90 s.
11. Observe sob um microscópio eletrônico de varredura com um detector de elétrons secundário na lente a 2-3 kV no modo de vácuo (5 x ^10-6 mA). Tire imagens com uma distância de trabalho de 8,1-8,2 mm e em ampliações de 675x, 1050x e 1570x.
    Observações: Todas as etapas são executadas no MD. Use 200-250 μL de solução para cada etapa.

8. Microscopia eletrônica de transmissão de organoides/esferoides inteiros em um hidrogel

1. Aqueça o fixador de Karnovsky a 37 °C. Aspirar o meio de cultura celular em torno do hidrogel no MD.
2. Fixe a amostra com o fixador de Karnovsky em RT por 1 h. Lave com dH₂O 3x por 15 min cada.
3. Pós-fixação com OsO₄ aquoso a 2% e ferrocianeto de potássio a 2,5% no RT por 45 min. Lave com dH₂O 3x por 10 min cada.
4. Incubar em tiocarbohidrazida a 0,5% (TCH; ver Tabela de Materiais) a RT durante 30 min. Lave com dH₂O 3x por 10 min cada.
5. Incubar em OsO₄ aquoso a 2% no RT por 30 min. Lave com dH₂O 3x por 10 min cada.
6. Incubar em solução de acetato de uranilo a 2% (ver Tabela de Materiais) a RT durante 1 h.
   NOTA: Nesta etapa, os esferoides podem ser mantidos a 4 °C durante a noite.
7. Incubar em solução de aspartato de chumbo (ver Tabela de Materiais) a 60 °C durante 45 min. Lave com dH₂O 3x por 10 min cada.
8. Desidratar em uma série graduada de etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) e acetona absoluta em RT por 15 min cada.
9. Trate com uma mistura de (1:1; 1:2) resina de acetona/Epon e resina Epon pura (ver Tabela de Materiais) em RT por 2 h cada.
10. Polimerizar a resina a 60 °C durante a noite (mínimo de 16 h). Após a polimerização, retire o bloco de resina do MD, como mostra a Figura 4 Suplementar.
11. Prenda o bloco de resina a um maior com uma cola de resina. Apare o bloco e alcance a localização de organoides ou esferoides.
12. Obtenha seções semifinas (1.000 nm) e ultrafinas (60 nm) usando um ultramicrótomo (consulte Tabela de materiais).
13. Coloque as seções ultrafinas em grades de cobre de malha 100 e observe sob um microscópio eletrônico de varredura com um detector STEM a uma tensão de aceleração de 30 kV. Capture imagens com uma distância de trabalho de 44 mm e em ampliações de 2580x, 5020x e 6060x.
    NOTAS: Use 200-250 μL de solução para cada etapa. As etapas 8.1-8.10 são executadas no MD.

O presente artigo representa um dispositivo multiuso (MD) e metodologias complementares para cultura, congelamento, descongelamento, coloração histológica, coloração imuno-histoquímica, marcação por imunofluorescência, revestimento e processamento de organoides ou esferoides inteiros ainda em um hidrogel em um único ambiente de design exclusivo. O estudo atual foi projetado para preparar esferoides de câncer de fígado HepG2 em 35 gotas de hidrogel em 35 MDs. Experimentos foram conduzidos em triplicado para garantir a precisão. Além disso, organoides pulmonares em DMs foram marcados como um exemplo de imunofluorescência para demonstrar os resultados das metodologias atuais para estudos organoides.

A Figura 1 mostra um olhar atento ao dispositivo que contém uma cúpula de hidrogel. O tamanho e a forma do nicho são projetados para fornecer um ambiente protetor para o hidrogel contendo os organoides / esferoides e salvar os reagentes usados durante vários processos. Além disso, a parte lateral do dispositivo que envolve o nicho pode ser usada como câmara de umidade durante experimentos de imunocoloração. O meio para alimentar a amostra pode variar entre 100-200 μL, dependendo da altura da gota de hidrogel. O presente estudo se concentra no método baseado em cúpula, uma vez que muitos hidrogéis, componentes comerciais da matriz extracelular e extratos de membrana basal permitem que o usuário prepare gotas. No entanto, também é possível preencher o nicho do MD com o hidrogel e, em seguida, semear as células dentro dele para gerar organoides / esferoides. Esse método pode ser preferido se a viscosidade da matriz não permitir a preparação de cúpulas ou se o experimento incluir grandes volumes de organoides. O tipo de hidrogel e a relação hidrogel/meio para a preparação de gotas podem variar de acordo com o tipo de célula, o desenho experimental e o meio. Figura 1  também representa o design do dispositivo que torna possível investigar os organoides / esferoides sob microscópios eletrônicos de campo brilhante, confocais e de varredura, enquanto organoides / esferoides ainda estão em seu ambiente nativo in vitro .

A Figura 2 apresenta como semear células em um hidrogel e examinar o desenvolvimento de esferoides ou organoides. O design e as dimensões do dispositivo multiuso também foram apresentados nessa figura. O vídeo 1 demonstra a localização de esferoides em crescimento 3D em um hidrogel. A Figura 3 representa imagens ao vivo de esferoides em crescimento do dia 3 ao dia 21. O tempo para a formação de esferoides e organoides pode variar de acordo com a natureza da amostra. Por exemplo, esferoides de células HepG2 e células HEK se formaram dentro de 3 dias, enquanto a formação de organoides hepáticos e biliares durou 2 semanas durante os experimentos.

Esferoides corados com hematoxilina e eosina são observados na Figura 4. A imagem representa esferoides bem preservados e homogeneamente corados em diferentes tamanhos e fusões de esferoides. Células vivas no centro dos esferoides são dignas de nota. A imagem também demonstra as delicadas conexões entre as células de diferentes esferoides. Essas conexões frágeis não podiam ser visualizadas após os fluxos de trabalho tradicionais, uma vez que a transferência, a pipetagem ou a centrifugação as danificariam. Figura 5  demonstra imunocoloração de esferoides com o anticorpo específico para Arginase, um dos marcadores mais comuns para o diagnóstico e prognóstico do carcinoma hepatocelular42,43. As micrografias revelam células cancerígenas hepáticas diferenciadas e indiferenciadas nos mesmos esferoides. Esta figura contém imagens com e sem contracoloração com hematoxilina. Os pesquisadores podem optar por omitir a contracoloração com hematoxilina nos casos em que seria difícil diferenciar áreas marcadas em uma estrutura 3D.

A Figura 6 representa outro protocolo simples para visualização completa de organoides/esferoides vivos em um hidrogel: coloração de membrana celular viva e núcleo. A metodologia permite a mesma densidade de marcação na periferia e no centro, mostrando penetração completa do reagente. A Figura 7, a Figura 8 e a Figura 9 mostram imagens representativas de esferoides marcados com um, dois ou três anticorpos, respectivamente. Um a três anticorpos primários são diluídos em S-IF simultaneamente. Da mesma forma, um a três anticorpos secundários correspondentes adequados para o experimento são diluídos simultaneamente em S-IF. O protocolo de imunomarcação permite que os pesquisadores marquem as estruturas 3D dentro de 4-6 h sem perdê-las ou danificá-las. O plano de fundo é transparente e a tecnologia usada aqui não requer métodos / soluções adicionais de limpeza, recuperação de antígenos ou bloqueio. O método também permite que os pesquisadores rotulem a amostra com múltiplos anticorpos em uma única etapa. Em outras palavras, o usuário prepara uma solução contendo um a três anticorpos primários e outra solução correspondente a um a três anticorpos secundários. O protocolo aqui descrito elimina etapas sequenciais de marcação com diferentes anticorpos em metodologias convencionais.

A Figura 10 representa imagens microscópicas eletrônicas de varredura e transmissão dos esferoides. A primeira linha demonstra imagens de esferoides inteiros no MD sob um microscópio eletrônico de varredura. A segunda linha contém imagens microscópicas eletrônicas de transmissão de esferoides após a preparação dos blocos de resina contendo esferoides de montagem inteira no MD, bem como imagens de esferoides seccionados e corados. Organelas citoplasmáticas bem preservadas e outras características ultraestruturais das células demonstram a eficácia deste protocolo simples, que protege a estrutura 3D de toda a amostra. O MD também permite que os pesquisadores congelem e descongelem as amostras de montagem inteira em um hidrogel. Figura 11  demonstra cúpulas de hidrogel e os esferoides em uma ampliação mais alta antes e depois do congelamento. A irregularidade nos limites da cúpula do hidrogel é notável. No entanto, a redondeza dos esferoides criopreservados é quase estável após o descongelamento em comparação com os esferoides antes do congelamento. Métodos de marcação de membrana celular viva e núcleo também são aplicados 48 h após o descongelamento para demonstrar como o procedimento de congelamento / descongelamento afetou a arquitetura 3D, a membrana celular e a viabilidade celular. A solução de congelamento tradicional contendo dimetilsulfóxido e a solução atual recém-formulada, SF, demonstram resultados semelhantes. Mais de 75% das estruturas 3D poderiam sobreviver neste protocolo. No entanto, mais experimentos são necessários para revelar os efeitos colaterais a longo prazo de cada formulação em organoides e esferoides.

A Tabela 1 e a Tabela 2 comparam os fluxos de trabalho tradicionais com os aqui descritos com base no número da etapa, duração e produção de resíduos (ou seja, o número total de luvas plásticas, pontas de pipeta, pipetas sorológicas, tubos de centrífuga, tubos de microcentrífuga, vasos de cultura celular, crioviais, etc. para cada fluxo de trabalho).

A Figura 1 suplementar representa etapas sequenciais que podem ser executadas em um único MD esquematicamente. A Figura 2 suplementar demonstra os resultados dos experimentos projetados para comparar a viabilidade celular, toxicidade e taxas de proliferação de células HepG2 em um MD ou em um prato tradicional com fundo de vidro. A Figura 3 Suplementar mostra as caixas de espuma que foram usadas para congelar as amostras em MDs. A Figura 4 Suplementar resume as etapas para retirar um bloco de resina de um MD. A Figura 5 suplementar inclui imagens de organoides das vias aéreas que foram marcados com imunofluorescência e, em seguida, visualizados enquanto ainda estavam em DMs. Da mesma forma, o Vídeo 2 demonstra dois organoides das vias aéreas marcados como imunofluorescentes em um DM. Finalmente, a Figura 6 Suplementar é um gráfico que compara a intensidade média da intensidade de marcação da membrana celular em esferoides vivos antes e depois do congelamento usando o fluxo de trabalho tradicional e o fluxo de trabalho descrito aqui. O software Image J tem sido utilizado para análise.

Figura 1: O dispositivo de cultura de células multiuso (MD). (A) O nicho (N), a parte central do dispositivo, é projetado para criar um ambiente protetor para os organoides / esferoides cultivados em uma gota de hidrogel (D) durante processos sequenciais. O lado (S), a parte circundante do nicho, pode ser usado como uma câmara umidificadora durante experimentos de imunocoloração. (B) O centro transparente na tampa permite que o usuário observe os organoides/esferoides quando o dispositivo está fechado. (C) A cúpula de hidrogel contendo organoides no MD pode ser corada ou embutida em um bloco de resina para microscopia eletrônica de transmissão. A tampa também inclui o nicho (N) para a metodologia de queda suspensa. O tamanho e o design do dispositivo permitem que o usuário examine os organoides / esferoides sob (D) campo brilhante, (E) confocal e (F) microscópios eletrônicos de varredura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Células semeadoras dentro de um hidrogel. (A) O pellet celular na pipeta é inserido no topo da cúpula. Após 3-5 dias, os esferoides tornam-se visíveis na cúpula, especialmente na periferia da gota. (B) Quatro imagens ao vivo de esferoides em crescimento de cada quarto em uma cúpula foram capturadas e fundidas. Barra de escala = 200 μm. (C)O design e as dimensões (em centímetros) do dispositivo multiuso (MD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Desenvolvimento de esferoides em uma gota de hidrogel do dia 3 ao dia 21. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Esferoides de montagem inteira corados com hematoxilina e eosina dentro do MD. Visualização das conexões entre as células localizadas nos esferoides adjacentes ou em fusão. Os processos delicados entre as células (setas) são visíveis, uma vez que a amostra de montagem inteira no hidrogel é fixada, corada e examinada sem danificar as estruturas de crescimento 3D. Barra de escala: dia 3, dia 9 = 50 μm; dia 7, dia 17 = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coloração imuno-histoquímica de esferoides de montagem inteira no hidrogel dentro do MD. As amostras foram imunocoradas com um anticorpo específico para Arginase. Arginase positiva (setas vermelhas) e negativa (setas pretas) células são vistas nos esferoides. As imagens são de dois experimentos: (A-C) sem e (D-F) com contracoloração com Hematoxilina. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagem confocal de um organoide vivo no hidrogel. Os organoides vivos foram marcados com as corantes de membrana celular viva (WGA) e núcleo (Hoechst). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Marcação por imunofluorescência de esferoides inteiros num hidrogel com um anticorpo e uma mancha nuclear (Hoechst). (A-C) O painel superior mostra um esferoide marcado com um anticorpo específico para Na-K ATPase na membrana celular. (D-F) O painel inferior demonstra a localização de outro anticorpo específico para a arginase, uma proteína citosólica específica para carcinoma hepatocelular, em esferoides de câncer de fígado. Duração do protocolo de coloração: 6 h. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Marcação por imunofluorescência de esferoides inteiros num hidrogel com dois anticorpos e uma mancha nuclear (Hoechst). (A-C) O painel superior mostra um esferoide marcado com dois anticorpos específicos para albumina e Ov6. Barra de escala = 5 μm. (D-F) O painel inferior demonstra a localização da proteína alfa feto e Ov6 em esferoides de câncer de fígado. Barra de escala = 20 μm. Duração do protocolo de coloração: 6 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Marcação por imunofluorescência de esferoides inteiros num hidrogel com três anticorpos e uma coloração nuclear (Hoechst). (A-E) O esferoide no painel superior é marcado com anticorpos específicos para Arginase, Na-K ATPase e beta-galactosidase. Barra de escala = 10 μm. (F-J) O painel do meio demonstra um esferoide marcado com Ov6, beta-galactosidase e proteína alfa-feto. Barra de escala = 20 μm. (K-O) O esferoide no painel inferior foi marcado com FITC-faloidina, anticorpo antimitocondrial e anticorpo anti-Golgi. Barra de escala = 20 μm. Observe a alta especificidade de rotulagem e o plano de fundo reduzido. Duração do protocolo de coloração: 6 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Imagens de microscopia eletrônica. (A-C) Imagens microscópicas eletrônicas de varredura de esferoides inteiros no hidrogel no MD. Barra de escala = 10 μm. (D-F) As características ultraestruturais das células em um esferoide também foram visualizadas sob um microscópio eletrônico de transmissão. Barras de escala: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Imagens ao vivo de esferoides antes e depois do congelamento. (A-F) A irregularidade das bordas das cúpulas de hidrogel é evidente após o congelamento. No entanto, o tamanho e a arredondamento dos esferoides permanecem semelhantes. (F) A migração celular na superfície da cultura pode ser observada após o descongelamento. (G-L) A coloração da membrana celular viva (WGA) e do núcleo (Hoechst) demonstram viabilidade celular semelhante e membranas celulares intactas antes e depois de congelar todos os esferoides em um hidrogel no MD. Escala basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação do número de etapas, tempo e produção de resíduos entre os fluxos de trabalho tradicionais e novos durante um experimento de curto prazo.

Tabela 2: Comparação do imunomarcador convencional e do novo protocolo de imunomarcação.

Vídeo 1: Séries temporais de imagens em diferentes níveis de um hidrogel contendo esferoides sob um microscópio de contraste de fase invertida. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Estrutura 3D de dois organoides das vias aéreas marcados com anticorpos para citoqueratina 5 e DAPI. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura 1 suplementar: Visão geral do experimento. Este esquema mostra as etapas experimentais sequenciais para o cultivo e exame de organoides de montagem inteira em um hidrogel. A tecnologia descrita aqui torna possível crescer, congelar, descongelar, rotular e examinar os organoides sob diferentes microscópios. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Comparação da viabilidade celular, toxicidade e taxas de proliferação de células HepG2 em um prato tradicional com fundo de vidro ou um MD. As células HepG2 foram cultivadas em(A) uma placa tradicional de cultura celular com fundo de vidro ou (B) em um MD para comparar a viabilidade celular e a toxicidade. (C) O teste de exclusão azul de tripano foi utilizado para demonstrar a viabilidade. Barra de escala = 20 μm. Os resultados foram comparados usando citotoxicidade (D-E) CCK8 e (F) ensaios de proliferação celular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Disposição das duas caixas de espuma. Uma caixa de espuma é colocada dentro da outra durante o processo de congelamento lento de todos os organoides ou esferoides no MD. *denota as duas caixas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 Suplementar: Etapas que demonstram como remover o bloco de resina do MD após a polimerização da resina. (A) O bloco de resina em torno dos esferoides ou organoides é preparado dentro do nicho MD e, em seguida, polimerizado. (B-D) Em seguida, com uma haste fina apropriada, o bloco de resina é empurrado para removê-lo do nicho. (E) Em seguida, o bloco de resina, com o plástico abaixo, é removido. (F-G) Finalmente, um par de pinças é usado para separá-los se o bloco ainda estiver preso ao plástico. (H) O bloco está pronto para seccionamento fino. Os organoides ou esferoides de montagem inteira no bloco de resina (*) estão prontos para seccionamento para microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 Suplementar: Organoides das vias aéreas que foram marcados com imunofluorescência e, em seguida, visualizados enquanto ainda estavam em MDs. (A-C) O painel superior mostra organoides circulares das vias aéreas com um lúmen central. O verde representa as células progenitoras das vias aéreas que expressam a citoqueratina 5 no anel mais externo do organoide, e o azul representa os núcleos. Barra de escala = 50 μm. (D-F) O painel inferior mostra a imagem tridimensional dos dois organoides lado a lado nos filtros (D) DAPI e (E) Alexa 488, bem como a imagem mesclada (F). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 Suplementar: Comparação da densidade de marcação nas membranas celulares vivas das células. O gráfico compara os esferoides antes e depois do congelamento usando o fluxo de trabalho tradicional e atualmente adotado. A análise foi realizada utilizando-se o software de análise de imagens Image J. Abreviaturas: IntDen = Densidade Integrada (intensidade de fluorescência nos esferoides selecionados). CTCF = Fluorescência celular total corrigida. Clique aqui para baixar este arquivo.

Ranan Gulhan Aktas possui pedidos de patentes MD, S-IHC, S-IF e FS. Olgu Enis Tok esteve envolvido no desenvolvimento destes produtos. Olgu Enis Tok e Gamze Demirel são membros da equipe de P&D da empresa chamada Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut e Ozgecan Kayalar não têm conflitos de interesse a declarar.