Artigo de método

Isolamento, ativação e expansão de células T baseadas em flotação de amostras de células mononucleares do sangue periférico humano usando microbolhas

DOI:

10.3791/64573

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23 de dezembro de 2022

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1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da separação baseada em flotação para isolar, ativar e expandir células T humanas primárias.

Resumo

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O processo de isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para estabelecer culturas ex vivo é crucial para pesquisa, testes clínicos e terapias baseadas em células. Neste estudo, um protocolo simples e novo para isolar, ativar e expandir células T de PBMCs ex vivo é apresentado. Este estudo utiliza a tecnologia funcionalizada de classificação celular ativada por flutuabilidade (BACS) para isolar e ativar células T. Resumidamente, o protocolo envolve a seleção positiva de células CD3+ de PBMCs derivados de leucopacos, seguida por uma co-estimulação de 48 horas com microbolhas de estreptavidina pré-conjugadas anti-CD28 (SAMBs) antes da transdução em placas de 24 poços. As microbolhas funcionalizadas oferecem uma oportunidade única de ativar células de forma flutuante, levando a fenótipos proliferativos que permitem a expansão com o mínimo de exaustão. Esta técnica oferece exaustão reduzida, pois as microbolhas co-estimulatórias permanecem flutuantes e retornam ao topo do meio de cultura, reduzindo assim a quantidade de tempo que as células em expansão estão em contato com os fatores co-estimulatórios. Os resultados indicam que as células T isoladas e cultivadas recebem estimulação suficiente para ativar e proliferar, mas não a um ponto que leva à superativação, o que leva à exaustão, como demonstrado pela presença de PD-1 excessiva.

Introdução

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Mais de 500 ensaios clínicos de terapia celular T com receptor de antígeno quimérico (CAR)-T estão sendo conduzidos em todo o mundo, e quatro produtos de terapia celular CAR-T estão disponíveis no mercado1. No entanto, ainda existem inúmeras necessidades de pesquisa e fabricação de células CAR-T que devem ser abordadas para melhorar a eficácia, a escalabilidade e o sucesso a longo prazo dessas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. A pesquisa e fabricação clínica adotiva de células CAR-T começa com o isolamento de células T de uma amostra de sangue periférico e a subsequente estimulação, transdução e expansão das células isoladas. Parâmetros como recuperação de células T, pureza e sinais de ativação/exaustão requerem consideração cuidadosa ao escolher as técnicas de isolamento e estimulação celular para pesquisa e fabricação de células CAR-T 3,4,6. É importante ressaltar que a melhora na persistência terapêutica das terapias com células CAR-T, minimizando os impedimentos biológicos decorrentes dos atuais processos de fabricação, como a exaustão das células T, é necessária para aumentar a eficácia terapêutica 6,7.

Como alternativa aos métodos tradicionais de isolamento celular, como a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS), aqui é demonstrada a classificação de células ativadas por flutuabilidade (BACS) com microbolhas para isolamento de células T. A separação de microbolhas utiliza microesferas flutuantes e ocas (microbolhas) para ligar os alvos e flutuá-los na superfície de amostras de fluidos 8,9. Ao funcionalizar microbolhas com anticorpos (ou seja, anti-CD3), as populações de células T desejadas podem ser selecionadas positivamente a partir de amostras de sangue periférico. Posteriormente, o uso de uma população diferente de microbolhas funcionalizadas por anticorpos (ou seja, anti-CD28) para co-estimular e ativar células T positivamente selecionadas em suspensão é demonstrado neste trabalho. As microbolhas oferecem um fluxo de trabalho de isolamento e ativação simples e altamente ajustável que gera células T prontas para cultura de células suspensas e aplicações a jusante, como modificação genética e expansão. Criticamente, a ativação celular flutuante com microbolhas promove estimulação celular contida para evitar a exaustão excessiva das células T7.

Para este estudo, a citometria de fluxo foi a principal ferramenta utilizada para analisar o sucesso de isolamento, ativação e transdução das microbolhas funcionalizadas, bem como para fornecer informações detalhadas sobre as subpopulações específicas presentes durante as fases de crescimento e expansão pós-transdução. Além da citometria de fluxo, a microscopia de campo brilhante e fluorescência foi usada para confirmar a saúde celular, morfologia e sucesso da transdução. Com base nesses resultados, a tecnologia e o protocolo de microbolhas fornecem uma alternativa mais ajustável e mais suave aos métodos tradicionais de isolamento e ativação atualmente em uso atualmente; em particular, as células ativadas por microbolhas apresentam uma expressão notavelmente menor de marcadores de exaustão de células T do que a normalmente observada com ferramentas e kits padrão da indústria.

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Protocolo

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1. Isolamento de células T com microbolhas usando seleção positiva

NOTA: Este protocolo detalha uma abordagem de seleção positiva CD3+ em pequena escala usando SAMBs.

  1. Incubar 3 x 108 PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mL de tampão de separação com anticorpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a uma concentração de 25 ng de anticorpo por 1 milhão de células (25 ng/M). Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e incube à temperatura ambiente durante 10 minutos.
  2. Adicione microbolhas de estreptavidina (SAMBs) a uma proporção de 0,5 (quantidade de SAMB):1 (quantidade de célula) de acordo com a concentração de SAMB relatada pelo fabricante.
  3. Misture usando um rotador comercial de ponta a ponta (EOE) a 20 rpm por 10-15 min à temperatura ambiente. Centrífuga durante 5 min a 400 x g à temperatura ambiente.
  4. Após a centrifugação, as células selecionadas positivamente estarão no topo da suspensão com os SAMBs. As células restantes não selecionadas estarão na pelota de célula na parte inferior do tubo. Usando uma pipeta de vidro 9, insira a ponta abaixo da camada de células de bolha no fundo do tubo, aspirar a pastilha de célula e o sobrenadante com uma pipeta eletrônica e transferi-los para um novo tubo.

2. Co-estimulação (ativação) das células T positivamente selecionadas

  1. Ressuspeite a camada de células de bolhas remanescente no tubo original em 1 mL de meio de célula T completo (ou outro meio desejado).
  2. Conte as células no subnadante com microscopia de campo brilhante usando um contador de células automatizado e subtraia esse valor do número de células iniciais para determinar o número de células capturadas na camada de células de bolha.
  3. Antes desta etapa, misture o anticorpo anti-CD28 biotinilado com SAMBs comerciais por um período mínimo de 2 h para criar os SAMBs anti-CD28 conjugados. Entre em contato com o fabricante do SAMB para determinar a quantidade de anticorpos anti-CD28 necessária para a conjugação. Adicione os SAMBs conjugados anti-CD28 à suspensão de células de bolhas resultante da etapa 2.1 usando uma proporção de 1,5 (SAMBs anti-CD28):1 (células).
  4. Misture usando a rotação EOE por 15 min e, em seguida, ajuste o volume total para 2 milhões de células por mL com meio de célula T completo ou outro meio desejado de acordo com o número de células obtido na etapa 2.2.

3. Expansão das células coestimuladas em meio de cultura celular

  1. Distribuir 1 mL de células ativadas a partir da etapa 2.4 a uma concentração de 2 M/mL por poço em uma placa de 24 poços. Incubar em incubadora de CO2 a 5% umidificado a 37 °C.
  2. Após 24 h, adicionar 50 U/mL de IL-2 e 25 ng/M de anti-CD3 solúvel (OKT3) para incentivar ainda mais a expansão, conforme calculado usando o número inicial de células banhadas no dia 0. Colocar a placa celular de volta na incubadora de CO2 humidificada e deixar incubar durante a noite a 37 °C.

4. Opcional: Transdução de células T ativadas com lentivírus

NOTA: A abordagem aqui utilizada é adaptada de Prommersberger et al. 10.

  1. Descongele o lentivírus à temperatura ambiente e misture brevemente por pipetagem.
  2. Remova suavemente o nadante médio, 600 μL de cada poço, sem tocar nas células filhas que estão agora no fundo do poço ou na camada de bolhas que permaneceu na superfície da solução.
  3. Adicione 5 μg/mL de brometo de hexadimetrina por poço para melhorar a transdução viral. Adicione as partículas lentivirais a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 (partículas lentivirais por célula).
  4. Centrifugar a placa durante 45 minutos a 800 x g e 32 °C utilizando aceleração lenta e sem quebra para desaceleração. Incubar as células durante 4 h numa incubadora de CO2 humidificada a 37 °C.
  5. Após 4 h, adicionar 600 μL de meio de células T completo fresco e comercialmente disponível e 50 U/mL de IL-2 a cada poço e colocar a placa celular de volta na incubadora de CO2 umidificada a 37 °C para expansão de células T.

5. Expansão das células T (com ou sem transdução prévia)

  1. A cada 2 dias, remova metade do meio do nadante médio, substitua-o por um meio de células T fresco e completo e adicione IL-2 a uma concentração de 50 U/mL.
  2. Conte as células T duas vezes por semana para avaliar a densidade celular. Quando a densidade celular exceder 2 x 10 6-2,5 x 106 células/mL, transfira as células para um vaso maior, diluindo-as para 5 x 105 células/mL.

6. Colheita das células T e citometria de fluxo

  1. Misture suavemente o conteúdo de cada poço pipetando para cima e para baixo. Remova todo o conteúdo do poço, incluindo as microbolhas, e transfira-as para um tubo de 1,5 mL.
  2. Lave cada poço com 400 μL de DPBS (−/−) sem cálcio e magnésio e transfira a solução para um tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 50 μL de tampão de separação.
  4. Manchar com um coquetel de anticorpos de ativação e exaustão/coloração e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Prepare os coquetéis de coloração da seguinte forma: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; coquetel de exaustão: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. Adicione 1 mL de tampão de separação e misture suavemente. Centrífuga a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente para lavar o excesso de anticorpos. Aspirar o sobrenadante completamente.
  6. Ressuspeite a pastilha celular em 1 mL de tampão de separação e transfira para um vaso apropriado (por exemplo, um tubo FACS, uma placa de 96 poços, etc.) para a análise de citometria de fluxo. O esquema de análise de citometria de fluxo recomendado está detalhado na Figura 1.

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Resultados

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As células T foram isoladas de PBMCs compradas e plaqueadas para ativação, conforme descrito no protocolo. As amostras de controle negativo (PBMCs comprados) não foram ativadas. Essas amostras de controle foram incluídas para demonstrar o efeito que o processo de ativação de microbolhas teve sobre as amostras experimentais em comparação com os controles de células T intocadas e não estimuladas, garantindo que os marcadores de ativação observados fossem o resultado dos fatores de ativação adicionados e não fossem inerente...

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Discussão

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O protocolo descrito permite o isolamento de células T de amostras de PBMC e a ativação de células T suspensas em meios de cultura com microbolhas. Este método baseia-se em microbolhas funcionalizadas cuja flutuabilidade inerente oferece uma oportunidade única de introduzir sinais co-estimulatórios nas células e ativá-los enquanto estão suspensos em um meio de cultura, reduzindo assim a exposição das células em expansão à estimulação prolongada; essa superestimulação pode resultar no aumento da expressão dos marcadores d...

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Divulgações

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Todos os autores, no momento da submissão, são funcionários da Akadeum Life Sciences, que fabrica e vende produtos de separação de microbolhas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoetanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Placas de Cultura Multi-Poços Biologix Placas de 24 poçosVWR 76081-560
Biotina anti-CD28 humano (28.2) AnticorpoBiolegend302904
Biotina anti-CD3 humano (OKT3) AnticorpoBiolegend317320
DPBS, sem cálcio, sem magnésioGibco14190-136
GlutaMAX SuplementoThermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Partícula Lentiviral rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
PBMCs Humanos NormaisBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicilina/Estreptomicina 100X para cultura de tecidosVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polybrene Reagente de Infecção/TransfecçãoMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
Soro Humano Agrupado AB Derivado de Plasma Inativado por Calor PesquisaInovadoraISERABHI100mL
RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX, HEPESGibco72400047
Kit de Microbolhas de Estreptavidina (inclui tampão de separação de Akadeum)Akadeum11110-000

Referências

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  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

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