O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da separação baseada em flotação para isolar, ativar e expandir células T humanas primárias.
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Artigo de método
Isolamento, ativação e expansão de células T baseadas em flotação de amostras de células mononucleares do sangue periférico humano usando microbolhas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O processo de isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para estabelecer culturas ex vivo é crucial para pesquisa, testes clínicos e terapias baseadas em células. Neste estudo, um protocolo simples e novo para isolar, ativar e expandir células T de PBMCs ex vivo é apresentado. Este estudo utiliza a tecnologia funcionalizada de classificação celular ativada por flutuabilidade (BACS) para isolar e ativar células T. Resumidamente, o protocolo envolve a seleção positiva de células CD3+ de PBMCs derivados de leucopacos, seguida por uma co-estimulação de 48 horas com microbolhas de estreptavidina pré-conjugadas anti-CD28 (SAMBs) antes da transdução em placas de 24 poços. As microbolhas funcionalizadas oferecem uma oportunidade única de ativar células de forma flutuante, levando a fenótipos proliferativos que permitem a expansão com o mínimo de exaustão. Esta técnica oferece exaustão reduzida, pois as microbolhas co-estimulatórias permanecem flutuantes e retornam ao topo do meio de cultura, reduzindo assim a quantidade de tempo que as células em expansão estão em contato com os fatores co-estimulatórios. Os resultados indicam que as células T isoladas e cultivadas recebem estimulação suficiente para ativar e proliferar, mas não a um ponto que leva à superativação, o que leva à exaustão, como demonstrado pela presença de PD-1 excessiva.
Introdução
Mais de 500 ensaios clínicos de terapia celular T com receptor de antígeno quimérico (CAR)-T estão sendo conduzidos em todo o mundo, e quatro produtos de terapia celular CAR-T estão disponíveis no mercado1. No entanto, ainda existem inúmeras necessidades de pesquisa e fabricação de células CAR-T que devem ser abordadas para melhorar a eficácia, a escalabilidade e o sucesso a longo prazo dessas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. A pesquisa e fabricação clínica adotiva de células CAR-T começa com o isolamento de....
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Protocolo
1. Isolamento de células T com microbolhas usando seleção positiva
NOTA: Este protocolo detalha uma abordagem de seleção positiva CD3+ em pequena escala usando SAMBs.
- Incubar 3 x 108 PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mL de tampão de separação com anticorpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a uma concentração de 25 ng de anticorpo por 1 milhão de células (25 ng/M). Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e incube à temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Adicione microbolhas de estreptavidina (SAMBs) a uma proporção de 0,5 (quantidade de SAMB):1 (quantidade de célula) de aco....
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Resultados
As células T foram isoladas de PBMCs compradas e plaqueadas para ativação, conforme descrito no protocolo. As amostras de controle negativo (PBMCs comprados) não foram ativadas. Essas amostras de controle foram incluídas para demonstrar o efeito que o processo de ativação de microbolhas teve sobre as amostras experimentais em comparação com os controles de células T intocadas e não estimuladas, garantindo que os marcadores de ativação observados fossem o resultado dos fatores de ativação adicionados e não fossem inerente.......
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Discussão
O protocolo descrito permite o isolamento de células T de amostras de PBMC e a ativação de células T suspensas em meios de cultura com microbolhas. Este método baseia-se em microbolhas funcionalizadas cuja flutuabilidade inerente oferece uma oportunidade única de introduzir sinais co-estimulatórios nas células e ativá-los enquanto estão suspensos em um meio de cultura, reduzindo assim a exposição das células em expansão à estimulação prolongada; essa superestimulação pode resultar no aumento da expressão dos marcadores d.......
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Divulgações
Todos os autores, no momento da submissão, são funcionários da Akadeum Life Sciences, que fabrica e vende produtos de separação de microbolhas.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Placas de Cultura Multi-Poços Biologix Placas de 24 poços | VWR | 76081-560 | |
| Biotina anti-CD28 humano (28.2) Anticorpo | Biolegend | 302904 | |
| Biotina anti-CD3 humano (OKT3) Anticorpo | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Suplemento | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Partícula Lentiviral rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| PBMCs Humanos Normais | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicilina/Estreptomicina 100X para cultura de tecidos | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Reagente de Infecção/Transfecção | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Soro Humano Agrupado AB Derivado de Plasma Inativado por Calor Pesquisa | Inovadora | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Kit de Microbolhas de Estreptavidina (inclui tampão de separação de Akadeum) | Akadeum | 11110-000 |
Referências
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell....
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Reimpressões e permissões
