Fracionamento subcelular para o isolamento de componentes sinápticos do cérebro murino

Summary

Este protocolo apresenta um método robusto e detalhado para obter sinaptossomos, vesículas sinápticas e outras frações sinápticas altamente puras do cérebro de camundongos. Este método permite a avaliação de processos sinápticos, incluindo a análise bioquímica da localização e função de proteínas com resolução compartimental.

Abstract

Os terminais sinápticos são os principais locais de comunicação neuronal. A disfunção sináptica é uma característica de muitos distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicos. A caracterização de subcompartimentos sinápticos por isolamento bioquímico é, portanto, um método poderoso para elucidar as bases moleculares dos processos sinápticos, tanto na saúde quanto na doença. Este protocolo descreve o isolamento de terminais sinápticos e subcompartimentos sinápticos de cérebros de camundongos por fracionamento subcelular. Primeiro, estruturas terminais sinápticas seladas, conhecidas como sinaptossomos, são isoladas após a homogeneização do tecido cerebral. Os sinaptossomos são compartimentos neuronais pré e pós-sinápticos com membranas pinçadas e seladas. Essas estruturas retêm um estado metabolicamente ativo e são valiosas para o estudo da estrutura e função sináptica. Os sinaptossomos são então submetidos à lise hipotônica e ultracentrifugação para obtenção de subcompartimentos sinápticos enriquecidos para vesículas sinápticas, citosol sináptico e membrana plasmática sináptica. A pureza da fração é confirmada por microscopia eletrônica e análise de enriquecimento bioquímico para proteínas específicas de compartimentos subsinápticos. O método apresentado é uma ferramenta direta e valiosa para estudar as características estruturais e funcionais da sinapse e a etiologia molecular de vários distúrbios cerebrais.

Introduction

Sinapses são as unidades computacionais básicas do cérebro através das quais os neurônios se comunicam e exercem funções diversas e requintadamente complexas. As sinapses são, portanto, fundamentais para a saúde do cérebro¹; a disfunção sináptica está implicada como fonte ou resultado de muitos distúrbios². As sinapses são constituídas por terminais pré e pós-sinápticos, extensões de dois neurônios diferentes que são estreitamente apostos e separados por uma fenda sináptica atravessada por moléculas de adesão sináptica. A informação flui do compartimento pré para o pós-sináptico na forma de mensageiros químicos chamados neurotransmissores¹. Os processos moleculares envolvidos na neurotransmissão são áreas ativas de pesquisa ^3,4,5. Compreender os processos patogênicos dentro dos terminais sinápticos e a resposta das sinapses à patologia em outros subcompartimentos neuronais são passos cruciais para o enfrentamento de distúrbios cerebrais ^1,2. Diversos avanços metodológicos, predominantemente aplicados aos modelos murinos, têm avançado nessa busca⁶. O isolamento de frações sinápticas por centrifugação diferencial é um desses métodos de mudança de paradigma que permitiu a avaliação detalhada dos processos sinápticos na saúde e na doença.

O cérebro humano adulto consiste em 80-90 bilhões de neurônios ^7,8. Entre as espécies murinas, o cérebro do rato contém aproximadamente ~ 200 milhões de neurônios, enquanto os ratos têm ~ 70 milhões ^9,10. Cada neurônio forma milhares de conexões sinápticas específicas com uma rede de neurônios altamente polarizados misturados com células gliais e vasculatura densa. Em tecidos tão complexos e heterogêneos, já foi impensável isolar e estudar sinapses como um sistema independente. Na década de 1960, Victor Whittaker, Catherine Hebb e outros tornaram isso possível isolando terminais sinápticos intactos usando fracionamento subcelular^11,12,13,14. Na tentativa de isolar vesículas sinápticas (SVs), homogeneizaram cérebros através de força de cisalhamento líquido em sacarose iso-osmótica (0,32 M) seguida de ultracentrifugação. Obtiveram terminais ou varicosidades nervosas intactas, pinçadas e fechadas na membrana plasmática, que denominaram partículas de terminação nervosa (NEPs)^11,13. Como as características estruturais e funcionais da sinapse foram preservadas nessas estruturas, os NEPs foram posteriormente denominados "sinaptossomos" por congruência com outras organelas subcelulares^13,15. Vale ressaltar que o trabalho de Eduardo de Robertis e colegas, que cunharam o termo "vesícula sináptica", sobrepôs-se ao de Whittaker e colegas e contribuiu para a validação do isolamento e caracterização dos "sinaptossomos"^16,17,18.

Os sinaptossomos são estruturas fisiologicamente ativas que contêm todas as propriedades celulares e moleculares necessárias para o armazenamento, liberação e recaptação de neurotransmissores^13,18. A preservação das principais características sinápticas in vitro e a ausência de componentes não sinápticos também contribuem para a utilidade deste método de isolamento. Os sinaptossomos têm contribuído imensamente para a compreensão das propriedades químicas e fisiológicas da neurotransmissão e agora estão sendo utilizados para estudar os processos moleculares sinápticos e suas alterações na doença 19,20,21,22,23. Os sinaptossomos também são o material de origem inicial para o isolamento de componentes sinápticos como SVs, vesículas revestidas de clatrina (CCVs), citosol sináptico, membrana plasmática sináptica, mitocôndrias sinápticas, moléculas de adesão sináptica e outros componentes de interesse, o que pode facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares da função sináptica^{18,19,20,24,25,26, 27,28}. Esses componentes subsinápticos podem ser obtidos pela lise osmótica dos sinaptossomos e ultracentrifugação do gradiente de densidade da sacarose^15,29. Embora o método original de fracionamento subcelular do grupo de pesquisa de Whittaker seja conhecido por ser eficiente no isolamento de sinaptossomos de qualidade e SVs ^13,30, otimizações recentes aumentam a pureza das frações subcelulares 22,23,31,32. Este artigo fornece uma versão altamente detalhada e acessível de um protocolo clássico para o fracionamento subcelular do tecido cerebral murino para isolar sinaptossomos, SVs e outros componentes subsinápticos.

Protocol

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Yale (Protocolo 2021-11117) e realizados em uma instalação credenciada pela Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Os cuidados com os animais e o alojamento estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório³³ e foram fornecidos pelo Yale Animal Resource Center (YARC). Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimentos e água. Cinco a oito camundongos ou dois a quatro ratos por genótipo ou condição são necessários para o seguinte protocolo. Menos ratos são necessários devido aos seus maiores volumes cerebrais. Do mesmo modo, a idade dos animais de experiência pode afectar o rendimento das fracções; camundongos adicionais podem ser necessários para idades inferiores a 2 meses. Caso contrário, os procedimentos descritos aplicam-se tanto a espécies murinas como a animais adultos saudáveis de qualquer idade. Os dados representativos apresentados neste estudo utilizaram camundongos do tipo selvagem (C57BL/6J) (idade = 2 meses; quatro machos e quatro fêmeas por repetição) obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação experimental

NOTA: Este protocolo requer ~11 h para que um único pesquisador seja concluído. É altamente recomendável concluir a configuração da bancada (Figura 1), a preparação do tampão (Tabela 1), o pré-resfriamento de centrífugas e rotores a 4 °C e a coleta e rotulagem dos materiais e equipamentos necessários (consulte Tabela de Materiais) no dia anterior à execução do protocolo, quando aplicável.

Figura 1: Configuração de bancada. Antes das dissecações cerebrais, (A) homogeneizadores de vidro de rejeição e (B) todos os tampões foram resfriados no gelo. (C) As soluções-mãe dos inibidores da protease foram descongeladas no gelo. Um segundo recipiente de gelo úmido para tubos de centrífuga, um Dewar de nitrogênio líquido (não mostrado) e (D) um recipiente de gelo seco para armazenamento de curto prazo das amostras congeladas em nitrogênio líquido foram obtidos. (E) Os tubos de microcentrífuga foram pré-marcados para todas as amostras, pois quatro alíquotas de cada amostra de fração subcelular por genótipo ou condição foram coletadas durante este procedimento (dica de economia de tempo: rotule cuidadosamente todos os tubos no dia anterior à realização do experimento). (F) Um recipiente apropriado de resíduos de risco biológico, (G) etanol a 70%, (H) ferramentas cirúrgicas e (I) uma almofada de superfície absorvente. Os tubos de centrífuga e descartáveis necessários foram reservados para acesso eficiente durante a implementação do protocolo (não mostrado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Prepare a bancada para a cirurgia e recolha a tesoura e a pinça necessárias para a excisão do cérebro (ver Tabela de Materiais). Pré-rotular tubos microcentrífugos de 1,5 mL para biópsias de cauda de camundongo e quatro tubos por fração coletada, conforme descrito na Figura 2.
2. Obtenha dois recipientes de gelo úmido, um recipiente de gelo seco e um frasco Dewar de nitrogênio líquido de bancada.
3. Descongelar as soluções de estoque de fenilmetilsulfonilo fluoreto (PMSF), pepstatina A, aprotinina e leupeptina no gelo (ver Tabela de Materiais). Prepare os buffers necessários (Tabela 1).
   NOTA: As soluções de sacarose podem ser preparadas com antecedência e armazenadas a 4 °C. No entanto, os inibidores da protease (existências e comprimidos descongelados) devem ser adicionados frescos a todos os tampões no início da experiência devido à instabilidade destes reagentes em soluções aquosas. Além disso, todos os tampões devem ser preparados com vidro sem detergente e água sem detergente para permitir a recolha de sinaptossomas intactos.
4. Arrefecer todos os tampões e homogeneizadores de vidro Dounce (ver Tabela de Materiais) no gelo. Ajuste as centrífugas a 4 °C e arrefeça os rotores a 4 °C.
5. Adicionar 14 mL de tampão A (Tabela 1) a um homogeneizador de rejeição sobre gelo.

Tabela 1: Composição dos tampões de fracionamento subcelular. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 2: Visão geral do protocolo de fracionamento subcelular. Esquema resumido das etapas de fracionamento subcelular e amostras coletadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Excisão do cérebro do rato

Figura 3: Anatomia craniofacial . (A) Vista dorsal de um crânio de rato com estruturas cranianas relevantes indicadas. (B) Vista lateral esquerda do crânio e do cérebro de um rato com estruturas cranianas relevantes e direções anatômicas indicadas. As linhas tracejadas representam os locais onde as incisões devem ser feitas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Anestesiar profundamente cada camundongo com 100% de isofluorano em uma câmara de anestesia localizada em um exaustor ou armário de biossegurança usando um método de gota aberta³⁴. Sacrificar cada rato por luxação da coluna cervical seguida rapidamente de decapitação. Alternar entre genótipos ou grupos experimentais para cada sacrifício e dissecação¹². Obter biópsias de cauda após a eutanásia extirpando 2 mm da ponta distal da cauda com tesoura fina. Armazenar o tecido para genotipagem.
2. Pulverize a cabeça decapitada com etanol a 70% para evitar que o cabelo adira ao tecido e aos instrumentos cirúrgicos durante a dissecção.
3. Inserir tesoura fina sob a pele na incisão de decapitação a uma profundidade pericraniana e fazer uma incisão sagital média até a sutura internasal (Figura 3A) para retrair o couro cabeludo do crânio.
4. Trabalhando a partir da área occipital em direção a cada aspecto temporal, aparar a fáscia e o músculo para expor a superfície externa do crânio além de cada meato acústico externo (Figura 3B).
5. Prenda o couro cabeludo e o aspecto rostral do crânio com a mão não dominante. Com o outro, insira uma tesoura fina de 2 mm no lado caudal do forame magno, onde a medula espinhal é visível saindo. Faça uma incisão na linha média até que a tesoura atinja a superfície interna do osso intraparietal (Figura 3; linhas tracejadas).
   NOTA: Durante a incisão inicial, a tesoura deve ser paralela à medula espinhal com pressão aplicada em direção à superfície interna do crânio para evitar danos ao tronco encefálico e cerebelo.
6. Mude o ângulo da tesoura para que as lâminas corram paralelamente à superfície dorsal do crânio. Continue avançando a incisão sagital média rostralmente através dos ossos parietal e frontal, usando as suturas sagital e interfrontal como guia. Use pressão ascendente constante para evitar danos ao córtex. Terminar a incisão logo após a sutura internasal (Figura 3A).
7. Faça uma pequena incisão perpendicular (~3 mm) ao osso nasal, rostral à sutura internasal, colocando a tesoura perpendicular ao crânio com cada lâmina posicionada em uma sutura nasal-pré-maxilar e fazendo um corte uniforme (Figura 3; linhas tracejadas).
   NOTA: Este passo aumentará a facilidade de retração do crânio e será fundamental para a coleta do bulbo olfativo se essa área for de interesse.
8. Ao fixar o aspecto rostral, use um lado de um par de pinças texturizadas para levantar suavemente o crânio do cérebro, depois lateralmente e ventralmente. Repita ao longo da linha média, conforme necessário, em seguida, para o outro hemisfério até que toda a superfície do cérebro esteja exposta.
9. Usando pinça curva ou uma espátula fina, levante suavemente o lado rostral do cérebro. Corte os nervos ópticos e cranianos para completar a excisão do crânio.
10. Para cada condição, coletar cinco a oito cérebros de camundongos juntos no homogeneizador Dounce de vidro refrigerado contendo 14 mL de tampão A (Tabela 1).

3. Preparação do sinaptossoma

Observação : os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 4.

Figura 4: Preparação do sinaptossoma. Esquema do passo 3, a geração de sinaptossomos (P2'). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Homogeneize os cérebros usando um homogeneizador Dounce de vidro em 12 passagens de cima para baixo a 500 rpm (total). Faça uma pausa breve a cada curso para baixo para garantir a homogeneização completa do tecido. Homogeneizar preferencialmente em um banho de gelo para evitar o aquecimento e a desnaturação de proteínas. Tomar alíquotas de 5 μL para a determinação da concentração de proteínas pelo ensaio de ácido bicinchonínico (BCA, ver Tabela de Materiais). Tome 100 μL de alíquotas de lisado de todo o cérebro para Western Blot (WB). Para esta e todas as amostras subsequentes (Figura 2), tomar duas alíquotas para BCA e duas alíquotas para WB. Congelar rapidamente todas as alíquotas coletadas em nitrogênio líquido e armazená-las a -80 °C.
2. Girar o cérebro total homogeneizado num tubo de centrífuga de fundo redondo de alta velocidade (14 ml) (ver Tabela de Materiais) a 800 x g durante 10 min a 4 °C para obter o sobrenadante (S1). Transfira S1 para um novo tubo de centrífuga, deixando o pellet para trás (P1), que contém células e núcleos intactos. Evite pipetar o pellet fofo, branco, solto e superficial. Tome 2 x 5 μL de S1 para BCA e 2 x 100 μL de S1 para WB.
3. Gire S1 a 9.000 x g por 15 min a 4 °C para obter o sobrenadante sinaptossomal (S2) e o pellet de sinaptossomo bruto (P2). Tome 2 x 10 μL de S2 para BCA e 2 x 500 μL de S2 para WB. Descarte o sobrenadante após a obtenção das alíquotas e prossiga para a próxima etapa com o pellet.
4. Ressuspender P2 em 3 mL de tampão gelado A com inibidores de protease e centrífuga a 9.000 x g por 15 min a 4 °C para obtenção do sobrenadante (S2') e sinaptossomos lavados (P2'). Descarte o sobrenadante e mantenha o pellet.
5. Ressuscite P2' em 3 mL de Tampão A. Evite ressuspender a porção vermelha escura no fundo do pellet, que contém principalmente mitocôndrias. Tome 2 x 20 μL de P2' para BCA e 2 x 100 μL de P2' para WB.
   NOTA: Isto pode ser conseguido misturando suavemente as bordas e a superfície do pellet para ressuspender os sinaptossomos lavados de branco enquanto direciona a ponta da pipeta para longe do centro vermelho do pellet.

4. Lise hipotônica

NOTA: Os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 5.

Figura 5: Lise hipotônica. Esquema do passo 4, a lise hipotônica dos sinaptossomos para gerar o sobrenadante de lise (LS1) e frações de membrana sinaptossomal (LP1). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Para a lise hipotônica dos sinaptossomos lavados, adicionar 9 volumes de tampão B resfriado (Tabela 1) à ressuspensão de P2' (~27 mL). Homogeneizar os sinaptossomos em um homogeneizador de vidro Dounce (três passagens para cima e para baixo a 500 rpm).
2. Transfira as amostras para tubos de centrífuga cônica tampados de 50 mL. Gire-os em um revólver de tubo em uma câmara fria de 4 °C por 15 min.
3. Centrífuga lisada P2' a 25.000 x g por 20 min a 4 °C para obtenção do sobrenadante de lise (LS1) e do pellet de lise contendo membranas sinaptossomais (LP1). Tome 2 x 50 μL de LS1 para BCA e 2 x 400 μL de LS1 para WB. Transfira o LS1 para um tubo de centrífuga tampado para ultracentrifugação (ver Tabela de Materiais).

5. Isolamento da vesícula sináptica

NOTA: Os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 6.

Figura 6: Isolamento da vesícula sináptica e isolamento da membrana plasmática sináptica. (A) Esquema da etapa 5, o isolamento das frações citosol sináptico (LS2) e vesícula sináptica (LP2) e (B) etapa 6, a geração de mielina (MF), membrana plasmática sináptica (SPM) e frações mitocondriais (Mito.) após a ultracentrifugação de gradientes de sacarose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Centrifugar LS1 num rotor ultracentrífugo de ângulo fixo (ver Tabela de Materiais) a 100 000 x g durante 60 min a 4 °C para obter sobrenadante de citosol sináptico (LS2) e pellet de vesícula sináptica (LP2). O LP2 será pequeno, translúcido e fortemente aderido ao lado do tubo de centrífuga.
2. Ressuscite LP2 em 500 μL de tampão A. Usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 1 mL, cisalhamento LP2 com trituração suave. Tome 2 x 10 μL de LP2 para BCA e 2 x 250 μL de LP2 para WB.
3. Transfira LS2 (~30 mL) para unidades de filtro centrífugo com um ponto de corte de 10 kDa (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Se proteínas menores que 10 kDa forem de interesse, unidades de filtro centrífugo de corte de 4 kDa estão disponíveis, mas resultarão em tempos de rotação mais longos.
4. Concentrar LS2 a aproximadamente 0,5 ml girando a 5000 x g até 1 h a 4 °C. Tome 2 x 10 μL de LS2 concentrado para BCA e 2 x 250 μL de LS2 concentrado para WB. Depois de iniciar o giro, prossiga diretamente para a etapa 6.1.

6. Isolamento da membrana plasmática sináptica

1. Ressuspender LP1 (etapa 4.3) em 1 mL de Tampão B (Tabela 1). Tome 2 x 10 μL de LP1 para BCA e 2 x 50 μL de LP1 para WB. Ajustar o LP1 restante para um volume final de 7,5 mL e uma concentração final de sacarose de 1,1 M com tampão B e tampão C (Tabela 1).
2. Transfira 7,5 mL de LP1 ressuspenso para um tubo ultracentrífugo de 14 mL (ver Tabela de Materiais). Sobreponha cuidadosamente o LP1 com 3,75 mL de Tampão D (Tabela 1) e, em seguida, sobreponha com 1,25 mL de Tampão A (ou um volume maior para preencher logo abaixo da parte superior do tubo de centrífuga). Evite pipetar para baixo o lado do tubo, o que irá interromper as interfaces de gradiente de sacarose. Depois de sobrepor cada fração de sacarose, marque a parte superior da solução com uma caneta. Equilibrar os tubos para ultracentrifugação em peso, não em volume, com a adição gota a gota de tampão A a menos de 10 mg. Centrífuga a 48.000 x g durante 2,5 h a 4 °C num rotor de ultracentrífuga de balde oscilante (ver Tabela de Materiais).
3. Adquira imagens dos gradientes intactos após a ultracentrifugação para documentar a distinção de cada interface de sacarose e o sucesso do fracionamento.
4. Remova cuidadosamente a camada superficial de sacarose 320 mM (tampão A). Recupere a fração de mielina (MF) na interface de sacarose de 320 mM/855 mM em um volume de 800 μL. Recuperar a fração da membrana plasmática sináptica (SPM) na interface de sacarose de 855 mM/1,1 M em um volume de 1.000 μL. Pipetar cada fração para cima da parede do tubo de forma circular para garantir que a fração completa seja coletada. Aspirar cuidadosamente a sacarose restante e recuperar o pellet mitocondrial (Mito.) ressuspendendo em 200 μL de tampão B. Tome 2 x 100 μL de MF para BCA e 2 x 10 μL de Mito. para BCA; dividir o restante de MF e Mito. amostras ao meio para WB.
5. Diluir a fração SPM com 2 volumes de tampão B (~2 mL) e, em seguida, centrifugar em um rotor de ângulo fixo em um tubo de centrífuga de 3,5 mL (ver Tabela de Materiais) a 25.000 x g por 20 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet SPM no tampão A para um volume final de 250 μL. Pegue 2 x 5 μL de SPM para BCA e divida o SPM restante ao meio para WB.
6. Realizar um BCA para determinar a concentração de proteína de cada amostra, contabilizando o volume de alíquota variável.
   NOTA: Para a análise de WB, a concentração de proteína de trabalho sugerida para todas as frações subcelulares é de 2 μg/μL (ou tão alta quanto alcançável para LS1 e MF).

Results

O método apresentado resulta em 11 frações subcelulares cerebrais que podem ser submetidas a uma purificação adicional e a várias formas de análise a jusante^35,36. O método padrão-ouro para avaliar a qualidade dos sinaptossomos, SVs²³ e outros componentes é a microscopia eletrônica (EM) (Figura 7). O immunoblotting quantitativo para proteínas presentes em frações subcelulares específicas também pode ser realizado para avaliar marcadores de pureza de fração (Figura 8). Por exemplo, a análise imunoblot das frações revela o enriquecimento da N-caderina (CDH2, nome UniProt) na fração da membrana plasmática sináptica (SPM), α-sinucleína (SYUA) no citosol sináptico (LS2), sinaptofisina (SYPH) na fração vesícula sináptica (LP2) e proteína básica de mielina (MBP) na fração de mielina (MF) quando comparada aos níveis de proteína no homogeneizado cerebral completo inicial (Total) (Figura 8 ). Uma vez que a pureza da fração tenha sido estabelecida (por exemplo, observe a ausência de CDH2 na fração LS2 ou o aumento de muitas vezes no SYPH na fração LP2), o immunoblotting quantitativo pode ser usado para determinar a localização de proteínas de interesse ou consultar diferenças na distribuição de proteínas entre genótipos ou tratamentos. Compreender a localização subcelular de proteínas sinápticas pode permitir a dissecção de funções proteicas não descritas anteriormente. Além disso, esse método pode elucidar defeitos de tráfico ou disfunção sináptica em estados de doença, especialmente quando emparelhado com ensaios funcionais. Por exemplo, nossa equipe usou esse método para identificar um pool de proteína palmitoila tioesterase 1 enzimaticamente ativa que é enriquecida no citosol sináptico¹⁹.

Figura 7: Microscopia eletrônica (EM) de sinaptossomos. (A) Imagem EM representativa de um sinaptossomo contendo vesículas sinápticas (seta). (B) Imagem EM representativa de um sinaptossomo com componentes pré (seta) e pós-sinápticos (seta dupla). (C) Imagem EM representativa de um sinaptossomo contendo vesículas sinápticas e uma mitocôndria (seta) (barras de escala = 100 nm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Análise de imunoblot das frações subcelulares. (A) Os marcadores de pureza da fração subcelular (indicados com a nomenclatura UniProt) estão adequadamente localizados em comparação com o homogeneizado do cérebro inteiro (total): N-caderina (CDH2) na fração da membrana plasmática sináptica (SPM), sinaptofisina 1 (SYPH) e sinaptojanina 1 (SYNJ1) na fração enriquecida da vesícula sináptica (LP2), α-sinucleína (SYUA) no citosol sináptico (LS2), e proteína básica de mielina (MBP) na fração de mielina (MF). (B) A análise de quantificação de immunoblot revela o enriquecimento (mudança de dobra em relação ao total) dos marcadores de pureza de fração. Os dados são representados como média ± desvio padrão em uma escala log10. A linha pontilhada indica uma mudança de 1,5 vezes (y = 0,176) (n = 3 replicar experimentos com 8 camundongos do tipo selvagem; idade = 2 meses; n = 4-5 manchas para SYPH, SYUA, MBP, com n = 3 valores plotados previamente publicados por Gorenberg et ^al.19; n = 5 para SYNJ1; n = 1 para CDH2). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Em seus estudos seminais, Whittaker e seus colegas usaram quatro critérios morfológicos para identificar sinaptossomos: (1) as estruturas têm uma membrana plasmática selada; (2) as estruturas contêm SVs semelhantes às dos terminais nervosos e varicosidades in situ em tamanho e número; (3) as estruturas possuem uma ou mais pequenas mitocôndrias; e (4) a membrana pré-sináptica é frequentemente aderida a um componente pós-sináptico^11,12,13. Embora os dois primeiros critérios geralmente se apliquem a todos os métodos de isolamento, nos protocolos mais recentes descritos neste artigo, nem todos os sinaptossomos resultantes terão mitocôndrias e terminais pós-sinápticos ligados. Aproximadamente 60% dos sinaptossomos terão mitocôndrias, e estima-se que apenas até 15% tenham terminais pós-sinápticos anexados³⁷. Se os componentes pós-sinápticos são de particular interesse, sabe-se que o uso de um tampão de homogeneização isotônico semelhante ao Krebs e filtração por pressão para enriquecimento produz altas concentrações de sinaptossomos com terminais pós-sinápticos (também denominados sinaptoneurossomas)^22,38.

O método de sacrifício do animal pode afetar a qualidade dos sinaptossomos e subfrações sinápticas. Animais adultos sacrificados usando um método de eutanásia que não requer anestesia resultarão na melhor qualidade de fração. Além disso, os cérebros devem ser recém-dissecados, não congelados e homogeneizados usando uma proporção de 1:10 de tampão de homogeneização (peso/volume) para as frações sinápticas mais viáveis²². O cérebro tem uma população heterogênea de sinapses que podem ser diferenciadas pelo tipo de neurotransmissores que carregam. A formação de sinaptossomas geralmente não é afetada pelo tipo de sinapse ou conteúdo de neurotransmissores¹³. Uma exceção são as fibras musgosas no cerebelo, que são conhecidas por serem interrompidas em condições ótimas para a obtenção de sinaptossomos do resto do cérebro^39,40. Assim, recomenda-se a remoção do cerebelo antes da homogeneização cerebral se a exclusão dessa região não afetar o objetivo experimental. Se estiver interessado em isolar sinaptossomos de um caráter neurotransmissor particular, áreas do cérebro que são enriquecidas para neurônios contendo o neurotransmissor de interesse podem primeiro ser isoladas. No entanto, essa abordagem imporá limitações ao rendimento da fração final, dependendo do tamanho da região de interesse (a idade dos animais também é, portanto, uma consideração). Existem métodos imunoquímicos para o isolamento de sinaptossomos neurotransmissores específicos, mas a viabilidade e o rendimento serão significativamente comprometidos²². Se a avaliação da viabilidade metabólica dos sinaptossomos for importante, a medida da liberação de neurotransmissores^41,42 ou certos ensaios enzimáticos ⁴³ pode ser empregada.

Contaminantes comuns em preparações de sinaptossomos incluem microssomos, mitocôndrias livres, SVs e membranas neuronais e gliais. A contaminação pode ser reduzida aumentando o número de lavagens nas frações P1 e P2²² e evitando a ressuspensão do pellet mitocondrial vermelho nas etapas subsequentes. Em experimentos em que a viabilidade metabólica e o tempo são cruciais, a redução do número de lavagens e o uso de gradientes de Ficoll ou Percoll sobre gradientes de sacarose serão úteis 44,45,46. Esses métodos também reduzem significativamente a contaminação. O protocolo original de Whittaker produziu SVs de alta qualidade. A otimização adicional por Nagy et ^al.23, incluída nesse método, produz VS com notável homogeneidade e pureza, sem comprometer significativamente o rendimento³⁶. Se subtipos específicos de VS forem de interesse, como SVs glutamatérgicos (contendo VGLUT-1) ou GABAérgicos (contendo VGAT-1), o imunoisolamento com anticorpos específicos pode ser realizado^47,48. Métodos alternativos também estão disponíveis para isolar CCVs de sinaptossomos, que, devido à densidade diferencial, podem não estar presentes na mesma interface que as SVs obtidas com esse método^20,49,50.

No geral, o presente protocolo para isolar componentes sinápticos pode ser ainda mais otimizado para obter frações com melhor homogeneidade e viabilidade com base na qualidade e quantidade do tecido cerebral de origem e nos objetivos experimentais. Para maiores detalhes sobre a solução de problemas, deve-se consultar os capítulos de livros de Dunkley e Robinson²² e Ganzella et ^al.36.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa TB de 1 mL	BD	309649
Eppendorf Tubes de 1,5 mL	USA Scientific	1415-2500
Tubo Ultra-Clear de Parede Fina de 14 mL,	Aberto Beckman Coulter	344060	Compatível com SW 40 Ti
23 Gauge Precision Glide Agulha Hipodérmica	BD	305145
26,3 mL, Frasco de Policarbonato com Montagem	de Tampa Beckman Coulter	355618	Compatível com Ti70
3.5 mL, Tubo de Polipropileno de Parede Aberta	Beckman Coulter	349623	Compatível com TLA-100.3
Tubos Falcon de 50 mL Unidade de	14-432-22		Fisher Scientific
	Millipore Sigma	UFC901024
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	1 mg/mL em diH2O
Centrífuga Avanti J-26 XP	Beckman Coulter	B22984	< Frasco
Dewar de HDPE de Bancada	Thermo Scientific	5028U19
C57BL/6J Mice	000664		Jackson Labs
5810R	Eppendorf	EP022628168	< 14.000 rpm
completos, Mini, Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease sem EDTA	Roche	11873580001	Adicione 1 comprimido por 50 mL de solução
Fórceps Curvo	Fine Science Tools	11273-20
Tesoura Cirúrgica	Fina Fine Science Tools	8r
Glas-Col Sistema de Homogeneização de Tecidos	Cole-Parmer	UX-04369-15
Gråefe Fórceps	Ferramentas de Ciência Fina	11650-10
Tubos de Centrífuga de Fundo Redondo de Policarbonato de Alta Velocidade	ThermoFisher	3117-0500	Compatível com JA20
Isofluorano	Henry Schein Saúde Animal	NDC 11695-6776-2
JA-20 Rotor	Beckman Coulter	334831
Leupeptina	American Bio	AB01108	1 mg/mL em diH2O
N-[2-Hidroxietil] piperazina-N'-[2-ácido etanossulfônico] (HEPES)	American Bio	AB00892
Optima L-80 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter		< Ultracentrífuga Optima TLX de 100.000 rpm
	Beckman Coulter		< 120.000 rpm
Pestatina A	Thermo Scientific	78436	1 mg/mL em
DMSO Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)	American Bio	AB01620
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23335	Para determinação da concentração de proteína
Pontas
Pipetas
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
Tesoura Cirúrgica	Ferramentas de Ciência Fina	14002-12
SW 40 Ti Rotor de Balde Oscilante	Beckman Coulter	331301
Pilão Revestido de Teflon e Moedor de Tecido de Almofariz	Thomas Scientific	3431D94
Ti70 Rotor	Beckman Coulter	337922
TLA-100.3 Rotor	Beckman Coulter	349490
Tubo Revólver	Dot Scientific	DTR-02VS