A cromatina é uma estrutura dinâmica e fluida mantida por interações proteína-DNA, bem como proteína-proteína. Ambas as proteínas histonas e não histonas estão envolvidas na manutenção da estrutura da cromatina. Como essas interações são mediadas e como a estrutura da cromatina se altera durante os processos que envolvem o DNA como substrato?
Muitas técnicas foram desenvolvidas para lançar luz sobre a dinâmica da proteína-DNA, bem como as interações proteína-proteína. Isso inclui técnicas biofísicas, como espectroscopia de CD, e métodos bioquímicos, como cromatografia de filtração em gel. Esta coleção destaca algumas dessas técnicas que podem ser usadas para explorar a dinâmica da arquitetura da cromatina.
A integridade do DNA pode ser analisada por citômetro de fluxo (FACS), e Ling et al.1 adaptam esse método para detectar defeitos funcionais do esperma humano. A fisiologia do esperma pode ser avaliada usando biomarcadores como danos ao DNA, potencial da membrana mitocondrial e apoptose do esperma. Ling et al. mostram que o FACS pode ser facilmente adaptado para monitorar cada um desses parâmetros para avaliar a fisiologia do esperma, demonstrando assim que a técnica é um kit de ferramentas prático e confiável para o diagnóstico de infertilidade masculina.
A espectroscopia de CD é possivelmente um dos métodos mais fáceis de investigar a conformação de proteína e DNA. Cada conformador de DNA tem um padrão de banda de assinatura. A mudança no padrão de banda pode ser correlacionada com a mudança na conformação do DNA e, portanto, a mudança na arquitetura do DNA pode ser monitorada na presença de proteínas interagindo usando um espectrofotômetro CD. Arya et al.2 usam essa técnica para estudar a mudança no DNA induzida pela interação com a proteína de remodelação da cromatina dependente de ATP, SMARCAL1, na ausência e presença de ATP. Eles mostram que as alterações na estrutura do DNA podem ser correlacionadas com a atividade transcricional da proteína.
A cromatografia de exclusão por tamanho e os ensaios pull-down são usados rotineiramente para monitorar as interações proteína-proteína. A montagem dos nucleossomos é facilitada por chaperonas de histonas que se ligam às histonas. Bobde et al.3 descrevem métodos e ensaios que podem ser usados para identificar se uma determinada função proteica é uma chaperona de histonas ou não.
Como investigamos os mecanismos de montagem de nucleossomos em tempo real? Técnicas de imagem de molécula única, como cortina de DNA, foram desenvolvidas para visualizar o processo de montagem em tempo real. A cortina de DNA é uma técnica híbrida que combina fluidez lipídica, microfluídica e microscopia de reflexão interna total para obter imagens da interação proteína-DNA em tempo real. Kang et al.4 descrevem a cortina de DNA como uma técnica para estudar o mecanismo subjacente à montagem da chaperona histona, Abo1, de S. pombe. As técnicas descritas fornecem uma maneira de examinar a dinâmica da cromatina, que desempenha um papel importante tanto na estabilidade genômica quanto na regulação epigenética dos processos que envolvem o material genético.
A imunoprecipitação tradicional da cromatina (ChIP) requer anticorpos específicos para a proteína de interesse. Muitas vezes, os anticorpos não são específicos o suficiente, levando a resultados falsos positivos, especialmente ao sondar os locais de ligação dos fatores de transcrição. Os anticorpos também nem sempre estão disponíveis para proteínas em todos os organismos. Candida albicans é um desses organismos para os quais os anticorpos não estão disponíveis. O método Cut and Run contorna essas limitações fundindo MNase ao fator de transcrição de interesse. Qasim et al.5 descrevem o uso desse método para determinar os sítios de ligação de fatores de transcrição em C. albicans.
Os métodos descritos nesta coleção fornecem um vislumbre das técnicas disponíveis para os pesquisadores. Todos esses métodos são versáteis e facilmente adaptáveis para responder às perguntas que o pesquisador está fazendo.