Method Article

Avaliação do Processo e Cinética da Expressão da Quitina Desacetilase Recombinante em Células de E. coli Rosetta pLysS Usando uma Técnica Estatística

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No protocolo atual, uma técnica estatística, planejamento composto central (CCD), foi aplicada para otimizar as condições de processo para a expressão da quitina desacetilase bacteriana recombinante (BaCDA) em células de E. coli Rosetta pLysS. O emprego de CCD resultou em um aumento de ~ 2,39 vezes na expressão e atividade de BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos últimos anos, a rota mais ecológica da desacetilação da quitina para quitosana usando a enzima quitina desacetilase ganhou importância. A quitosana convertida enzimaticamente com características emuladoras tem uma ampla gama de aplicações, particularmente no campo biomédico. Várias quitina desacetilases recombinantes de várias fontes ambientais foram relatadas, mas não há estudos sobre otimização de processos para a produção dessas quitina desacetilases recombinantes. O presente estudo utilizou a metodologia de planejamento composto central de superfície de resposta para maximizar a produção de quitina desacetilase bacteriana recombinante (BaCDA) em E. coli Rosetta pLysS. As condições otimizadas do processo foram concentração de glicose de 0,061%, concentração de lactose de 1%, temperatura de incubação de 22 °C, velocidade de agitação de 128 rpm e 30 h de fermentação. Em condições otimizadas, a expressão devido à indução de lactose foi iniciada após 16 h de fermentação. A expressão máxima, biomassa e atividade de BaCDA foram registradas 14 h após a indução. Na condição otimizada, a atividade BaCDA do BaCDA expresso foi aumentada ~ 2,39 vezes. A otimização do processo reduziu o ciclo total de fermentação em 22 h e o tempo de expressão em 10 h pós-indução. Este é o primeiro estudo a relatar a otimização do processo de expressão de quitina desacetilase recombinante usando um projeto composto central e seu perfil cinético. A adaptação dessas condições ideais de crescimento pode resultar em uma produção econômica e em larga escala da moneran desacetilase menos explorada, embarcando em uma rota mais ecológica para a produção de quitosana de grau biomédico.

Introduction

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A quitina, um polímero natural ligado a 1-4 glicosídicos de β estrutural, é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza depois da celulose. Apesar disso, a quitina tem aplicações industriais limitadas devido à sua insolubilidade1. Esse gargalo é resolvido submetendo a quitina à N-desacetilação, que confere uma carga positiva e aumenta a solubilidade do polímero resultante, a quitosana1. A quitina pode ser modificada para quitosana por duas vias diferentes: química e enzimática. A aplicação biomédica da quitosana requer desacetilação controlada e definida, que é restrita em vias químicas 2,3. Essa limitação pode ser abordada usando quitina desacetilases (CDAs), uma abordagem enzimática verde para o processo de desacetilação 4,5.

A quitina desacetilase pertence à família carboidrato esterase 4 (CE-4), definida no banco de dados de enzimas ativas de carboidratos (CAZY). As enzimas da família CE-4 compartilham a homologia NodB ou domínio polissacarídeo desacetilase como região conservada. O design composto central (CCD), uma ferramenta estatística, é usado para a otimização de várias enzimas modificadoras de quitina do tipo selvagem 6,7,8,9. No entanto, as etapas a jusante no uso de organismos do tipo selvagem tornam-se tediosas, daí a mudança para enzimas recombinantes 10,11,12,13,14,15,16,17. Nos últimos anos, os CDA recombinantes halofílicos de origem marinha ganharam importância devido à sua facilidade na aplicação industrial e produção de quitosana de grau biomédico18,19.

A produção de enzimas recombinantes em E. coli tem uma limitação no processo, e a otimização do meio é necessária, pois sua expressão em E. coli varia dependendo do gene e do plasmídeo usado20. Assim, a triagem de um processo adequado e parâmetros de nutrientes torna-se importante. Um fator de cada vez (OFAT), o método de otimização comumente empregado, requer enormes recursos e tempo para realizar experimentos passo a passo. Esse método sofre de falta de informações estatísticas sobre a interação entre os parâmetros20,21,22,23. Portanto, a metodologia CCD de superfície de resposta (RSM) foi adotada para estudar o rendimento da expressão da quitina desacetilase bacteriana halofílica (BaCDA) e a atividade de BaCDA em E. coli Rosetta pLysS. Os parâmetros considerados para otimização da expressão no hospedeiro de E. coli foram concentração de lactose, concentração de glicose, temperatura de incubação, taxa de agitação e tempo de incubação. Na maioria dos estudos de expressão de E. coli, o meio Luria Bertani (LB) com isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi usado como indutor. Essa adição de IPTG exigiu monitoramento regular do crescimento24. Essas mediações recorrentes durante o processo fermentativo também abrem caminhos para contaminação. Assim, os grupos de pesquisa mudaram para o caldo fantástico (TB) com lactose como indutor. A inclusão de lactose na mídia em vez de IPTG aborda essa preocupação; E. coli consome essa lactose e produz alo-lactose como subproduto, resultando em uma condição de auto-indução. Este meio auto-indutor inclui glicerol, que exibiu melhores rendimentos de proteína recombinante25.  Essa superexpressão de proteínas recombinantes em meio TB foi melhorada ainda mais com a otimização dos parâmetros do processo. No presente estudo, um delineamento composto central foi aplicado para otimizar a expressão heteróloga de BaCDA halofílico em células de E. coli Rosetta pLysS. Os parâmetros de processo escolhidos foram temperatura de incubação, taxa de agitação e tempo de incubação, e os parâmetros nutricionais avaliados foram concentração de glicose e lactose. A expressão halofílica de BaCDA foi avaliada com a condição otimizada prevista e validada cruzada usando SDS-PAGE.

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Protocol

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1. Meios de expressão e condição de cultura

  1. Transformar o vector pET-22b que contém o gene BaCDA em células competentes para E. coli Rosetta pLysS, utilizando o método do choque térmico, tal como descrito no ponto15.
    NOTA: Deve-se ter cuidado ao trabalhar com microrganismos. Todo o trabalho microbiológico deve ser realizado dentro de uma coifa de gabinete de biossegurança para evitar contaminação.
  2. Realizar o estudo preliminar de expressão em meio TB contendo 0,05% (p/v) de glicose e 0,2% (p/v) de lactose a 16 °C e 180 rpm. Cultive 6,792 x 107 células E. coli Rosetta pLysS em 100 mL de meio contendo plasmídeo clonado BaCDA até atingir a fase estacionária. Nas condições de crescimento mencionadas, as células de E. coli Rosetta pLysS atingem uma densidade óptica 600 (OD600) de 10,85 ± 0,21. 
    NOTA: Composição do meio TB (% p/v): triptona, 1,2; extrato de levedura, 2,4; glicerol, 0,6; e 1x TB de sal (17 mM KH2PO4 e 74 mM K2HPO4)17.

2. Otimização e desenho experimental

  1. Projete os experimentos e ajuste o modelo polinomial de segunda ordem no projeto composto central usando o software da ferramenta estatística. O software estatístico utilizado no presente estudo foi o MINITAB 17.0 (versão de teste).
    1. Para fazer isso, abra o software e clique nos seguintes botões: Stat > DoE > Superfície de resposta > Criar superfície de resposta > Response design > Central composite. A saída aparece como uma caixa de diálogo.
  2. Alimente os cinco parâmetros, temperatura de incubação, taxa de agitação, tempo de incubação, concentração de glicose e concentração de lactose, em cinco níveis (-2, -1, 0, +1, +2) na caixa de diálogo.
    1. Para fazer isso, insira os parâmetros com os níveis na caixa de diálogo, insira os detalhes de todos os parâmetros e pressione OK. Isso gera a matriz de planejamento experimental com seis repetições no ponto central, exigindo 32 ensaios experimentais. O software gera uma tabela contendo os parâmetros e seus níveis em termos codificados e não codificados, utilizados na otimização do processo utilizando CCD (Tabela 1).
  3. Realize os 32 experimentos com as condições geradas por software. Alimente os resultados experimentais na matriz de planejamento experimental (gerada pelo software) contendo níveis e parâmetros em termos de unidades codificadas e não codificadas (Tabela 2).
  4. Analisar a matriz de planejamento experimental (Tabela 2) utilizando o software. Para fazer isso, abra o software e alimente a resposta na planilha de dados. Selecione a coluna Resposta > Estatística > DoE > Superfície de resposta > Analisar o design da superfície de resposta > OK. A saída é analisada quanto à significância estatística e um modelo é previsto pelo software.

Tabela 1: Os parâmetros e seus níveis em termos codificados e não codificados usados no projeto experimental para estimar a expressão da quitina desacetilase recombinante em células pLysS de E. coli Rosetta. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Matriz de projeto experimental com atividade experimental e prevista de BaCDA (expressão) de quitina desacetilase recombinante em células de E. coli Rosetta pLysS. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Validação do modelo

  1. Valide o modelo projetado usando a ferramenta otimizada de resposta disponível no software.
  2. Repita a fermentação em condições ótimas previstas pelo software e compare o valor experimental com o valor previsto pelo software.
    1. Para fazer isso, abra o software e selecione a coluna Resposta > Estatística > DoE > superfície de resposta > Otimizador de resposta > Maximizar > OK. A saída são as condições ideais do processo e os valores previstos pelo software. Repita a fermentação nas condições ideais previstas e compare os valores.

4. Métodos analíticos

  1. Expressão, biomassa e quantificação de proteínas
    1. Realizar a fermentação em 32 condições dadas pelo software na matriz de planejamento experimental (Tabela 2). Obter o pellet após cada ensaio, centrifugando a cultura a 5,405 x g durante 10 min a 4 °C. Pesar o pellet celular para determinar o rendimento da biomassa.
      NOTA: Todo o manuseio microbiano deve ser feito em condições assépticas (ou seja, dentro de cabines de biossegurança).
    2. Lise o pellet celular para obter proteína periplasmática por sonicação. Adicione 5 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) a cada grama de pellet celular e interrompa sonicando por 10 ciclos com um pulso de 10 s ligado e 10 s desligado a 60% de amplitude. Recolher o lisado centrifugando a 5,405 x g durante 10 min a 4 °C. Quantificar a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford26.
      NOTA: Para evitar a desnaturação das proteínas, a sonicação deve ser feita em condições frias. Coloque as amostras no gelo durante a sonicação.
    3. Analise a expressão BaCDA usando SDS-PAGE seguido pelo software ImageJ. Carregue 10 μL de lisado de células solúveis (proteína periplasmática) em gel de bis-acrilamida a 12% e passe sob 1x tampão tris-glicina-SDS (TGS) a uma corrente de 100 V por 2 h. Após a conclusão da corrida, pinte o gel com azul Coomassie e destrate para remover o fundo27.
    4. Capture uma imagem usando uma unidade de documentação de gel. Determine a expressão BaCDA comparando a intensidade da banda na forma dos valores de pixel usando o software ImageJ. Considere a execução experimental com a menor atividade de BaCDA e biomassa como o pixel de referência 28.
      1. Para fazer isso, abra o software e abra o arquivo de imagem e selecione cada pista usando a caixa retangular. Vá para Analisar e defina cada pista como 100% e, em seguida, selecione a banda superexpressa em cada pista usando a caixa retangular. Vá para Analisar e determine a intensidade da banda, repita o processo em cada pista e exporte o resultado como .xls arquivo. Considere a intensidade da banda da corrida experimental com a menor atividade de BaCDA como intensidade de referência e analise a expressão de cada pista.
  2. Ensaio de atividade enzimática
    1. Determinar a atividade de BaCDA usando um kit de ensaio de acetato15, usando quitina de etilenoglicol (1 mg/mL; EGC) como substrato29.
    2. Deixar reagir 20 μL de BaCDA com 40 μl do substrato na presença de 40 μl de tampão Tris-HCl (pH 7) a 50 mM durante 1 h a 30 °C, agitando a 800 rpm.
    3. Após 1 h, centrifugue o reagente de 100 μL através de uma coluna de 3 kDa a 2,111 x g por 15 min a 4 °C. Rejeitar o retentado constituído por BaCDA e recolher o filtrado contendo acetato libertado durante a reacção. Utilizar o filtrado para o ensaio de acetato para determinar a actividade de BaCDA.
      NOTA: Uma unidade da enzima é definida como a atividade que libera 1 μM de acetato do substrato por microlitro de enzima por minuto. O ensaio de atividade enzimática foi realizado em triplicatas, e a respectiva atividade enzimática foi calculada de acordo.
  3. Cinética de fermentação da indução de lactose
    1. Investigue o perfil de atividade para determinar o ponto de indução da lactose e o ponto de início da expressão. O perfil de atividade é feito estimando a biomassa e a atividade de BaCDA com as condições de fermentação otimizadas.
    2. Determine a concentração de glicose no meio usando um kit de estimativa de glicose. Plote o perfil de atividade usando biomassa, concentração de glicose e atividade de BaCDA em relação ao tempo de fermentação.

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Results

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Otimização do processo de expressão da enzima quitina desacetilase recombinante periplasmática em E. coli usando planejamento composto central (CCD)
A construção pET22b-Ba CDA, quando cultivada em condições não otimizadas, proporcionou um rendimento máximo de biomassa e atividade de BaCDA de 22,26 ± 0,98 g/L e 84,67 ± 0,56 U/L, respectivamente15. No presente estudo, uma abordagem estatística CCD foi adotada para encontrar as condições ideais de proces...

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Discussion

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A quitina desacetilada, quitosana, tem muitas aplicações, especialmente na área biomédica30. No entanto, a reprodutibilidade da quitosana em relação ao seu grau de acetilação (DA) e padrão de acetilação (PA) é uma grande preocupação, além de outras apreensões ambientais. A rota mais verde, usando enzimas, foi assim explorada. A matriz de CDAs pode ser empregada para criar quitosana com um padrão único de desacetilação, o que aumentaria suas aplicações biomédicas 4,5

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer à Manipal Academy for Higher Education (MAHE) pelo fundo MAHE UNSW, e os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Pesquisa Científica e Industrial - Grupo de Desenvolvimento de Recursos Humanos (CSIR-MHRD), Govt. da Índia por uma bolsa de pesquisa sênior, carta de premiação número 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I datada de 31.3.2019.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KitsKit de
ensaio de acetatoMegazyme, IrlandaK-ACETAKO protocolo foi ligeiramente modificado e otimizado para realizar o ensaio em placa de 96 poços
Kit de estimativa de glicoseAgappe diagnosis Ltd., Índia12018013O protocolo foi ligeiramente modificado e otimizado para realizar o ensaio em placa
de 96 poços< forte> produtos químicos< / ácido acético >
forte Hi-media, ÍndiaAS001Usado para preparar a solução de coloração e destaing SDS-PAGE
AcrilamidaHi-media, ÍndiaMB068Usado para preparar SDS-PAGE
gel Pursulfato de amônioHi-media, ÍndiaMB003Usado para preparar SDS-PAGE gel
Bis-acrilamidaHi-media, ÍndiaMB005Usado para preparar o gel SDS-PAGE
Coomassie azul brilhante G-250Hi-media, ÍndiaMB092Usado para preparar a solução de coloração e destaing SDS-PAGE
Coomassie azul brilhante R-250Hi-media, ÍndiaMB153Usado para preparar o ensaio de Bardford
Etileno glicol quitosanoSigma-aldrich, EUAE1502Usado para preparar quitina de etilenoglicol e quitina de etilenoglicol foi usado como substrato para reação enzimática
D-glicoseHi-media, ÍndiaMB037Usado como componente de mídia.
ImidazolHi-media, ÍndiaGRM1864Usado no tampão de lise
LactoseHi-media, ÍndiaGRM017Usado como componente de mídia.
MetanolFinar, Índia30930LC250Usado para preparar a solução de coloração e destaing de SDS-PAGE
Cloreto de sódio (NaCl)Hi-media, ÍndiaMB023Usado em tampão de lise
Ácido fosfóricoHi-media, ÍndiaMB157Usado para preparar o ensaio de Bardford
dodecil sulfato de sódio (SDS)Hi-media, ÍndiaGRM6218Usado para preparar o gel SDS-PAGE
Fosfato de sódio dibásico anidroHi-meio, ÍndiaMB024Usado para preparar sald de TB para mídia e tampão para reação enzimática.
Fosfato de sódio monobásico anidroHi-media, ÍndiaGRM3964Usado para preparar sald de TB para mídia e tampão para reação enzimática.
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)Hi-media, ÍndiaMB026Usado para preparar o gel SDS-PAGE
Tris baseHi-media, ÍndiaMB029Usado para preparar o gel SDS-PAGE
TriptonaHi-media, ÍndiaRM7707Usado como um componente de mídia.
Extrato de leveduraHi-media, ÍndiaRM027Usado como componente de mídia.
Equipment
AlphaImager Unidade de documentação em gel HPProteinSimple, USA92-13823-00Usado para capturar fotografias SDS-PAGE
Mixer de bancadaEppendorf, Alemanha 9.776 660Usado para manter para reação enzimática com adaptador de 2 mL
Agitador de bioincubadoraInstrumentos Trishul, Índia13410622Usado para incubar cultura bacteriana em diferentes temperaturas e RPM
BioespectrofotômetroEppendorf, Alemanha 6135000009Usado para fazer todas as leituras espectroscópicas
Centrífuga de resfriamentoEppendorf, Alemanha 5805000017Usado para centrifugar cultura, lisado e todos os outros protocolos de centrifugação
Banho secoLabnet International, EUAS81522039Usado para desnaturar amostra de proteína para Micropipetas SDS-PAGE
Eppendorf, Alemanha 3123000900Usado através do protocolo para medições de volume
Rocker shakerTrishul instruments, Índia11770719Usado para agitar o gel SDS-PAGE para coloração e descoloração
unidade SDS-PAGEBio-Rad, EUA1658001FCUsado para fundir e executar o gel SDS-PAGE
Ultra sonicatorSonics & Materials, Inc., USAVCX 130Usado para lisar a célula bacteriana por ultra sonicação
Balança de pesagemSartorius, AlemanhaBSA124 SUsado para medir o peso em todo o protocolo
Devices
Nanosep Dispositivos centrífugos com membrana ômega (3 kDa)PALL life sciences, EUAOD003C33Usado para separar a enzima após o substrato treatment
SoftwaresVersãoDesenvolvida no
MINITAB17.0  (Versão de teste)  A Universidade Estadual da PensilvâniaUsado para projetar o modelo experimental e analisar os dados
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Usado para analisar o nível de expressão usando SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, EUA69744Armazenado em &menos; 20 &graus; C
Células
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, EUA70956Mantido em Luria– Caldo Bertani (LB) contendo 25% de glicerol a − 80 &graus; O
da

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