Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae

Summary

Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae é um organismo modelo amplamente utilizado em genética, evolução e biologia molecular. Nos últimos anos, tornou-se também um organismo modelo popular para estudar problemas relacionados à especiação. O ciclo de vida da levedura envolve as fases reprodutiva assexuada e sexuada. A facilidade de realizar experimentos evolutivos e o curto tempo de geração do organismo permitem o estudo da evolução das barreiras reprodutivas. A eficiência com que os dois tipos de acasalamento (a e α) se acasalam para formar o diploide a/α é referida como a eficiência de acasalamento. Qualquer diminuição na eficiência de acasalamento entre os haploides indica uma barreira pré-zigótica. Assim, para quantificar a extensão do isolamento reprodutivo entre dois haploides, um método robusto para quantificar a eficiência reprodutiva é necessário. Para tanto, um protocolo simples e altamente reprodutível é apresentado aqui. O protocolo envolve quatro etapas principais, que incluem remendar os haploides em uma placa YPD, misturar os haploides em números iguais, diluir e plaquear para colônias únicas e, finalmente, calcular a eficiência com base no número de colônias em uma placa de drop-out. Marcadores auxotróficos são empregados para fazer claramente a distinção entre haploides e diploides.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, comumente chamada de levedura brotante, é um eucariota unicelular. Tem dois tipos de acasalamento, a e α, e exibe ciclos reprodutivos assexuados e sexuados. Os tipos de acasalamento a e α são haploides e podem se dividir mitoticamente na ausência do outro tipo de acasalamento no ambiente circundante, que representa o ciclo assexuado das leveduras. Quando os dois tipos de acasalamento estão próximos, eles param de se dividir mitoticamente e se fundem para formar uma célula diploide. A levedura diploide pode se dividir mitoticamente quando os nutrientes estão presentes....

Protocol

NOTA: O protocolo envolve amplamente as seguintes etapas: (1) remendar os haploides nas grades de eficiência de acasalamento em uma placa YPD, (2) misturar os haploides em números iguais após 24 h de incubação e dar aos haploides mistos algumas horas para acasalar (7 h neste estudo), (3) plaquear as células mistas em YPD para isolar colônias únicas após 7 h a 30 °C, e, finalmente, (4) determinação do número de diploides formados pelos marcadores auxotróficos. Essas etapas são discutidas em detalhes a seguir (consulte também a Figura 2).

1. Aplicação de patches de haploides nas grades de eficiência de aca....

Results

Quantificação da eficiência reprodutiva dos dois tipos de acasalamento
O protocolo aqui descrito foi utilizado para quantificar a eficiência reprodutiva entre duas linhagens de leveduras - entre SK1AM a e SK1AM α e entre ScAMa eScAM α (Figura 3A). Nesses experimentos, o acasalamento entre os dois haploides foi repetido pelo menos 12 vezes. Em cada uma das repetições do experimento, pelo menos 100 colônia.......

Discussion

A quantificação da eficiência reprodutiva em S. cerevisiae é essencial para a realização de estudos relacionados aos genes envolvidos nas vias de acasalamento ou para o estudo da influência do ambiente externo no comportamento reprodutivo. Nas últimas duas décadas, S. cerevisiae também se tornou um modelo popular para abordar questões relacionadas à especiação14,36,37,38. A pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder grau regular para bacteriologia	SRL	19661 (0140186)
Sulfato de Amônio, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glicose	Sigma Life Science	G8270
	HiMedia	PW008	Dimensão de 90 mm x 15 mm
L-Arginina	Sigma Life Science	A8094
Ácido L-aspártico	Sigma Life Science	A7219
Monocloreto de L-histidina monohidratado	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucina	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucina	Sigma Life Science	L8912
L-Lisina	Aldrich	62840
L-Metionina	Sigma Life Science	M5308
L-fenilalanina	Sigma Life Science	P5482
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tirosina	Sigma Life Science	T8566
L-valina	Sigma Life Science	V0513
Acasalamento grade			1 cm x 1,5 cm grade retangular desenhada na placa de Petri
Tubos de microcentrífuga	Tarsons	500010
Peptona	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Extrato de Levedura em Pó	HiMedia	RM027
Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos e Sulfato	de AmônioBD Difco	233520