Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.
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Artigo de método
Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Saccharomyces cerevisiae é um organismo modelo amplamente utilizado em genética, evolução e biologia molecular. Nos últimos anos, tornou-se também um organismo modelo popular para estudar problemas relacionados à especiação. O ciclo de vida da levedura envolve as fases reprodutiva assexuada e sexuada. A facilidade de realizar experimentos evolutivos e o curto tempo de geração do organismo permitem o estudo da evolução das barreiras reprodutivas. A eficiência com que os dois tipos de acasalamento (a e α) se acasalam para formar o diploide a/α é referida como a eficiência de acasalamento. Qualquer diminuição na eficiência de acasalamento entre os haploides indica uma barreira pré-zigótica. Assim, para quantificar a extensão do isolamento reprodutivo entre dois haploides, um método robusto para quantificar a eficiência reprodutiva é necessário. Para tanto, um protocolo simples e altamente reprodutível é apresentado aqui. O protocolo envolve quatro etapas principais, que incluem remendar os haploides em uma placa YPD, misturar os haploides em números iguais, diluir e plaquear para colônias únicas e, finalmente, calcular a eficiência com base no número de colônias em uma placa de drop-out. Marcadores auxotróficos são empregados para fazer claramente a distinção entre haploides e diploides.
Introdução
Saccharomyces cerevisiae, comumente chamada de levedura brotante, é um eucariota unicelular. Tem dois tipos de acasalamento, a e α, e exibe ciclos reprodutivos assexuados e sexuados. Os tipos de acasalamento a e α são haploides e podem se dividir mitoticamente na ausência do outro tipo de acasalamento no ambiente circundante, que representa o ciclo assexuado das leveduras. Quando os dois tipos de acasalamento estão próximos, eles param de se dividir mitoticamente e se fundem para formar uma célula diploide. A levedura diploide pode se dividir mitoticamente quando os nutrientes estão presentes....
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Protocolo
NOTA: O protocolo envolve amplamente as seguintes etapas: (1) remendar os haploides nas grades de eficiência de acasalamento em uma placa YPD, (2) misturar os haploides em números iguais após 24 h de incubação e dar aos haploides mistos algumas horas para acasalar (7 h neste estudo), (3) plaquear as células mistas em YPD para isolar colônias únicas após 7 h a 30 °C, e, finalmente, (4) determinação do número de diploides formados pelos marcadores auxotróficos. Essas etapas são discutidas em detalhes a seguir (consulte também a Figura 2).
1. Aplicação de patches de haploides nas grades de eficiência de aca....
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Resultados
Quantificação da eficiência reprodutiva dos dois tipos de acasalamento
O protocolo aqui descrito foi utilizado para quantificar a eficiência reprodutiva entre duas linhagens de leveduras - entre SK1AM a e SK1AM α e entre ScAMa eScAM α (Figura 3A). Nesses experimentos, o acasalamento entre os dois haploides foi repetido pelo menos 12 vezes. Em cada uma das repetições do experimento, pelo menos 100 colônia.......
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Discussão
A quantificação da eficiência reprodutiva em S. cerevisiae é essencial para a realização de estudos relacionados aos genes envolvidos nas vias de acasalamento ou para o estudo da influência do ambiente externo no comportamento reprodutivo. Nas últimas duas décadas, S. cerevisiae também se tornou um modelo popular para abordar questões relacionadas à especiação14,36,37,38. A pr.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses concorrentes neste trabalho. Os autores estão felizes em compartilhar as cepas derivadas do SK1 para todo uso sem fins lucrativos.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma bolsa DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632) para S.S. P.N. é um Research Fellow apoiado por uma bolsa DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632). A.M. é apoiado pelo Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Governo da Índia, como Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). Os autores agradecem a Paike Jayadeva Bhat pelas discussões.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder grau regular para bacteriologia | SRL | 19661 (0140186) | |
| Sulfato de Amônio, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glicose | Sigma Life Science | G8270 | |
| HiMedia | PW008 | Dimensão de 90 mm x 15 mm | |
| L-Arginina | Sigma Life Science | A8094 | |
| Ácido L-aspártico | Sigma Life Science | A7219 | |
| Monocloreto de L-histidina monohidratado | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucina | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucina | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lisina | Aldrich | 62840 | |
| L-Metionina | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-fenilalanina | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Treonina | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tirosina | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-valina | Sigma Life Science | V0513 | |
| Acasalamento grade | 1 cm x 1,5 cm grade retangular desenhada na placa de Petri | ||
| Tubos de microcentrífuga | Tarsons | 500010 | |
| Peptona | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Extrato de Levedura em Pó | HiMedia | RM027 | |
| Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos e Sulfato | de AmônioBD Difco | 233520 |
Referências
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics.
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Reimpressões e permissões
