Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Resumo

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Resumo

A composição do microbioma intestinal pode ter um impacto dramático na fisiologia do hospedeiro ao longo do desenvolvimento e da vida do animal. Medir as mudanças composicionais no microbioma é crucial para identificar as relações funcionais entre essas mudanças fisiológicas. Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema hospedeiro para examinar os drivers moleculares das interações hospedeiro-microbioma. Com seu plano corporal transparente e micróbios naturais marcados com fluorescência, os níveis relativos de micróbios dentro do microbioma intestinal de um animal de C. elegans individual podem ser facilmente quantificados usando um grande classificador de partículas. Aqui descrevemos os procedimentos para o arranjo experimental de um microbioma, coleta e análise de populações de C. elegans no estágio de vida desejado, operação e manutenção do classificador, e análises estatísticas dos conjuntos de dados resultantes. Também discutimos considerações para otimizar as configurações de classificação com base nos micróbios de interesse, o desenvolvimento de estratégias de confinamento eficazes para os estágios de vida de C. elegans e como utilizar as capacidades de classificação para enriquecer as populações animais com base na composição do microbioma intestinal. Exemplos de aplicações potenciais serão apresentados como parte do protocolo, incluindo o potencial de escalabilidade para aplicativos de alto rendimento.

Introdução

A evolução animal está sob constante influência microbiana¹. A partir de diversos micróbios no ambiente, os hospedeiros animais adquirem parceiros específicos² que ampliam as capacidades do hospedeiro e impulsionam sua fisiologia e suscetibilidade a doenças³. Por exemplo, análises metagenômicas do microbioma intestinal descobriram classes metabólicas enriquecidas de genes microbianos que podem conferir maior colheita e armazenamento de energia em camundongos obesos⁴, muitos dos quais também são encontrados no microbioma intestinal humano

Protocolo

1. Preparação da mistura do microbioma

1. Carimbar ou riscar bactérias de um congelador de glicerol em uma placa de caldo de lisogenia (LB), ou meio de crescimento apropriado, e crescer durante a noite a uma temperatura ideal com base em cepas bacterianas de interesse (tipicamente 25 °C para micróbios naturais de C. elegans ).
2. A partir da placa LB, use uma única colônia de cada isolado bacteriano (por exemplo, 12 bactérias da coleção CeMbio) para inocular 800 μL de meio LB em poços separados de uma placa de poço profundo de 1 mL. Incubar durante a noite à temperatura ideal com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Este protocolo é oti....

Resultados

Definição de portões populacionais de adultos e larvas
Aqui, C. elegans L1s sincronizados foram cultivados em uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Eco), uma dieta padrão de laboratório. Populações de C. elegans foram coletadas para análise de LPS após 96 h ou 120 h de crescimento a 20 °C (Figura 2A). Um gráfico de pontos de extinção (EXT, um proxy de densidade corporal) versus tempo de voo (TOF, um proxy de comprimento do corpo) cria duas nuv.......

Discussão

A vermimetria de fluxo tem sido utilizada para caracterizar genes e vias de C. elegans contra a colonização e toxicidade de patógenos em diversos estudos^21,22. Aqui, uma abordagem de alto rendimento é apresentada que usa C. elegans para investigar como os microbiomas intestinais modulam sua fisiologia hospedeira. Em comparação com os métodos existentes que utilizam unidades formadoras de colônias (UFC) ou sequenciamento do amplicon de 16S rRNA <.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrífuga de fundo cônico de 15 mL	VWR	10026-076
96 placas de poços profundos (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 placas de poços profundos (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
Placa Costar de 96 poços	Ágar Corning	3694
	Millipore Sigma		O ágar bacteriologia padrão também é suficiente.
Coletor de aspiração	V& P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Solução de alvejante			Misture Alvejante com Hipoclorito de Sódio 5M 2:1 (v/v)
Leitor Multimodo de Imagem Celular	Centrífuga de	OD bacteriano	Cytation 5
	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	Para placa de 96 poços e tubos cônicos
Microscópio Fluorescente	Nikon	TiE
ggplot: Várias Ferramentas de Programação R para Plotagem de Dados.	Pacote R	Versão 3.3.2
Amostrador automático de partículas grandes	Union Biometrica	LP Sampler
Classificador de partículas grandes	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisol	Caldo	de
(LB)	RPI	L24066	LB padrão receitas caseiras usando bacto-triptona, extrato de levedura e NaCl também são suficiente.
Solução M9			22 mM KH2PO4 monobásico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Meio de crescimento de nematóides	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 adicionado após autoclavagem.
RStudio	GNU	Versão 1.3.1093
Hipoclorito de sódio	Sigma-Aldrich		5M
NaOH Microscópio estéreo	Nikon	SMZ745
Placas de Petri estéreis de 10 cm de diâmetro	Corning	351029
Placas estéreis de 12 poços	VWR	10062-894
Placas estéreis de 24 poços	VWR	10062-896
Placas de Petri estéreis de 6 cm de diâmetro	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787