Artigo de método

Geração de um modelo de tireoidite autoimune espontânea em camundongos

DOI:

10.3791/64609

⸱

17 de março de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

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Vários tipos de modelos animais de tireoidite de Hashimoto foram estabelecidos, assim como a tireoidite autoimune espontânea no camundongo NOD. Camundongos H-2h4 são um modelo simples e confiável para indução de HT. Este artigo descreve essa abordagem e avalia o processo patológico para uma melhor compreensão do modelo murino de TAA.

Resumo

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Nos últimos anos, a tireoidite (TH) de Hashimoto tornou-se a doença autoimune da tireoide mais comum. Caracteriza-se pela infiltração linfocitária e detecção de autoanticorpos séricos específicos. Embora o mecanismo potencial ainda não esteja claro, o risco de tireoidite de Hashimoto está relacionado a fatores genéticos e ambientais. Atualmente, existem vários tipos de modelos de tireoidite autoimune, incluindo tireoidite autoimune experimental (TAE) e tireoidite autoimune espontânea (TAS).

O EAT em camundongos é um modelo comum de TH, que é imunizado com lipopolissacarídeo (LPS) combinado com tireoglobulina (Tg) ou suplementado com adjuvante de Freund completo (CFA). O modelo de camundongo EAT é amplamente estabelecido em muitos tipos de camundongos. No entanto, a progressão da doença está mais provavelmente associada à resposta do anticorpo Tg, que pode variar em diferentes experimentos.

O TSA também é amplamente utilizado no estudo da TH no NOD. Rato H-2h4. O ACENO. O camundongo H2h4 é uma nova cepa obtida do cruzamento do camundongo diabético não obeso (NOD) com o B10. A(4R), que é significativamente induzida para HT com ou sem iodo alimentar. Durante a indução, o NOD. Camundongos H-2h4 apresentam alto nível de TgAb acompanhado de infiltração linfocitária no tecido folicular tireoidiano. No entanto, para este tipo de modelo de camundongo, existem poucos estudos para avaliar de forma abrangente o processo patológico durante a indução de iodo.

Um modelo de camundongo SAT para pesquisa de TH é estabelecido neste estudo, e o processo de mudança patológica é avaliado após um longo período de indução de iodo. Através deste modelo, os pesquisadores podem compreender melhor o desenvolvimento patológico da TH e selecionar novos métodos de tratamento para a TH.

Introdução

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A tireoidite de Hashimoto (TH), também conhecida como tireoidite linfocítica crônica ou tireoidite autoimune, foi relatada pela primeira vez em 19121. A TH é caracterizada por infiltração linfocitária e dano ao tecido folicular tireoidiano. Os exames laboratoriais se manifestam principalmente como aumento de anticorpos específicos da tireoide, incluindo anticorpo antitireoglobulina (TgAb) e anticorpo antitireoperoxidase (TPOAb)2. A incidência de TH está na faixa de 0,4%-1,5%, correspondendo a 20%-25% de todas as doenças tireoidianas, e esse valor tem aumentado nos últimosanos3. Além disso, um grande número de estudos relata que a TH está associada à oncogênese e recorrência do carcinoma papilífero de tireoide (CPT)4,5; Os potenciais mecanismos ainda são controversos. A tireoidite autoimune também é um fator importante na infertilidade feminina6. Portanto, a patogênese da TH precisa ser clara, para a qual um modelo animal simples e estável é essencial.

Para estudar a etiologia da TH, dois tipos principais de modelos murinos têm sido empregados, incluindo a tireoidite autoimune experimental (TAE) e a tireoidite autoimune espontânea (TAA) em nossosestudos7,8. Camundongos suscetíveis foram imunizados com antígenos tireoidianos específicos (incluindo tireoide bruta, tireoglobulina purificada [TG], peroxidase tireoidiana [TPO], ectodomínio TPO recombinante e peptídeos TPO selecionados) para estabelecer o modelo murino EAT. Além disso, os adjuvantes, incluindo lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante completo de Freund (CFA) e outros adjuvantes não usuais, também são usados durante a imunização para quebrar a tolerância imunológica 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

O modelo SAT é um modelo importante para estudar o desenvolvimento espontâneo da tireoidite autoimune, que é baseado em NOD. Camundongos H-2h4. O ACENO. O camundongo H-2h4 é uma nova cepa obtida a partir do cruzamento de NOD e B10. Camundongos A(4R), seguidos de múltiplos retrocruzamentos para NOD, com o gene IAk de suscetibilidade à tireoidite autoimune18,19. ACENO. Camundongos H-2h4 não desenvolvem diabetes, mas apresentam alta incidência de tireoidite autoimune e síndrome de Sjögren (SS)19. Estudos descobriram que a molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1) é altamente expressa no tecido tireoidiano de NOD. Camundongos H-2h4 com 3-4 semanas de idade. Além disso, com o aumento da ingestão de iodo, a imunogenicidade da molécula de tireoglobulina é aumentada, o que aumenta ainda mais a expressão de ICAM-1, que desempenha um papel importante no processo de infiltração de monócitos21. Este modelo simula o processo autoimune enquanto verifica a relação entre a dose de iodo e a gravidade da doença. O método estabelecido é estável, com alta probabilidade de sucesso. O modelo SAT tem sido aplicado para induzir tireoidite autoimune por muitos anos e continua a ser um método eficaz para estudar a patogênese da tireoidite autoimune. No entanto, o método atual de construção do modelo EAT é mais complicado e caro; Diferentes laboratórios utilizam diferentes métodos de imunização e locais de injeção. Além disso, camundongos com diferentes origens genéticas têm diferentes taxas de indução, que precisam de mais estudos para revelar o potente mecanismo.

No entanto, o desenvolvimento de tireoidite no modelo SAT está associado ao iodeto de sódio, dimorfismo sexual e condições de criação. Para revelar o procedimento apropriado da tireoidite autoimune no modelo TAA, este artigo descreveu o método de indução da tireoidite autoimune em diferentes condições. Além disso, permite o estudo da patogênese e evolução imunológica da tireoidite autoimune em diferentes estágios dessa doença.

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Protocolo

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O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelas diretrizes de cuidados e uso estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan.

1. Preparo

  1. Alojar todos os camundongos em condições específicas livres de patógenos sob ciclos claro-escuro de 12 h (começando às 07:00 e 19:00, respectivamente). Manter a temperatura ambiente a 22 °C. Troque os materiais de cama toda semana. Fornecer quantidades adequadas de ração padrão para roedores e água.
  2. Ao preparar a solução-mãe de NaI em água, pesar 2,5 g do composto e dissolvê-lo em 50 mL de água pura estéril sob vórtice para dar uma solução-mãe de 5%. Conservar esta solução-mãe num congelador a 4 °C, evitando a luz, durante até 8 semanas.
  3. Para preparar uma solução de trabalho de NaI, retirar 2,5 mL de solução-mãe e dissolvê-la em 250 mL de água normal como água potável diária para NOD. Camundongos H-2h4, para dar uma solução funcional de 0,05%.

2. Indução da tireoidite

  1. Modelo SAT
    1. Prepare o NOD. Camundongos H-2h4 (8 semanas de idade) para o estudo alojando todos os camundongos de um único sexo (sem dimorfismo sexual) em gaiolas de barreira (cinco animais por gaiola) com as condições de alimentação descritas na etapa 1.1.
    2. Induzir tireoidite autoimune no NOD. Camundongos H-2h4, alimentam todos os camundongos com NaI 0,05% por 8 semanas. Mude a água de NaI toda semana e avalie o status dos camundongos semanalmente, incluindo aparência, peso, apetite, estado mental e mobilidade.
  2. Modelo EAT
    1. Preparar os camundongos BALB/c (8 semanas de idade) para o estudo alojando todos os camundongos de um único sexo (sem dimorfismo sexual) em gaiolas de barreira (cinco animais por gaiola) com as condições de alimentação descritas na etapa 1.1. Alimentar todos os camundongos com NaI a 0,05% por 8 semanas.
    2. Durante as primeiras 2 semanas, injetar por via subcutânea uma mistura de CFA e Tg (200 μL) uma vez por semana.
    3. A partir da terceira semana, injetar por via subcutânea uma mistura de RIFI e Tg (200 μL) uma vez por semana durante 3 semanas.

3. Medições

  1. Preparação de amostras de sangue periférico
    1. Após a indução, anestesiar os camundongos com volume de 0,01 mL/g de anestésico por injeção intraperitoneal. Preparar o anestésico misturando midazolam (40 μg/100 μL para sedação), medetomidina (7,5 μg/100 μL para sedação) e tartarato de butorfanol (50 μg/100 μL para analgesia) em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
      OBS: As concentrações específicas de cada componente da mistura anestésica são: midazolam 13,33μg/100μL, medetomidina 2,5μg/100μL e butorfanol 16,7μg/100μL. Para dosagens específicas utilizadas em camundongos, as doses são: midazolam 4μg/g, medetomidina 0,75μg/g e butorfanol 1,67μg/g. A profundidade da anestesia foi confirmada quando os músculos dos membros do camundongo relaxaram, os bigodes não tiveram resposta ao toque e houve perda do reflexo pedal.
    2. Depois que os camundongos forem anestesiados, prepare as amostras de sangue periférico, fixando o camundongo com uma mão e pressionando a pele do olho para projetar o globo ocular. Em seguida, insira o tubo capilar no canto interno do olho e penetre em um ângulo de 30-45 graus até o plano da narina. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo capilar. O sangue fluirá para o tubo através da ação capilar.
    3. Colocar o sangue num frigorífico a 4 °C durante 2 h e, em seguida, centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C para obter a amostra. Para uma análise mais aprofundada, conservar o resto da amostra a -80 °C.
  2. Preparo de amostras de tecido tireoidiano
    1. Eutanasiar humanamente o animal de acordo com as políticas institucionais. Em seguida, dissecar a parede torácica para expor o coração, abrir o átrio direito e infundir soro fisiológico no ventrículo esquerdo por uma agulha de infusão intravenosa acoplada a uma seringa de 20 mL até que o tecido fique branco.
    2. Fixe o mouse na mesa de dissecção com pinos. Esterilizar o pescoço com etanol 75%. Corte a pele do rato ao longo da linha mediana do pescoço do topo do esterno até a mandíbula inferior com tesoura de tecido para expor completamente o tecido do pescoço.
    3. Observe o par de glândulas róseas, as glândulas submandibulares, abaixo das quais está o músculo traqueal anterior. Separe as glândulas e o músculo com tesoura oftálmica e pinça para expor a traqueia e a cartilagem tireoide.
    4. Separe o tecido sob a cartilagem, usando pinças curvas para pegar a cartilagem e a traqueia juntas. Cortar as extremidades distal e proximal da cartilagem e traqueia, respectivamente, e remover a glândula tireoide juntamente com a traqueia.
    5. Imergir as glândulas em paraformaldeído a 4% por 12-24 h. Em seguida, transferir o tecido para etanol 70%.
    6. Colocar os lóbulos individuais do material de biópsia tireoidiana nos de processamento e desidratar através do seguinte gradiente alcoólico seriado: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanol por 40 min cada; 1/2 xileno + 1/2 etanol absoluto por 2 h; 100% xileno por 1,5 h; 100% xileno por 1,5 h; 1/2 xileno + 1/2 parafina por 2 h; forno a 40°C por 40 min; parafina I por 30 min; e parafina II por 30 min. Embuta-os em blocos de cera de parafina.
    7. Antes da coloração, descerpar cortes de tecido tireoidiano de 5 μm de espessura em xileno (como segue) e reidratar através das seguintes concentrações decrescentes de etanol: xileno I por 10 min; xileno II por 10 min; xileno III por 10 min; etanol absoluto I por 5 min; etanol absoluto II por 5 min; álcool a 90% por 5 min; álcool a 80% por 5 min; álcool a 70% por 5 min; e álcool a 50% por 5 min.
    8. Corar os tecidos com hematoxilina e eosina (H&E). Manchar com hematoxilina por 15 min, enxaguar com água da torneira por 15 min, adicionar etanol de ácido clorídrico a 1% por 10 s, enxaguar com água corrente e, em seguida, com etanol a 50%, 70% e 80%, cada um por 3 min. Realizar coloração de etanol eosina 0,5% por 2 min e enxaguar com água corrente. Colocar as seções de parafina sucessivamente em etanol 75% por 2 min, etanol 85% por 2 min, etanol absoluto por 5 min e xileno por 5 min. Fixe as fatias com goma neutra e lâminas de vidro.
    9. Para avaliar a extensão da tireoidite linfocítica, pontuar os cortes tireoidianos da seguinte forma: 0: pouca ou nenhuma infiltração linfocitária no tecido tireoidiano; 1+: mais de 1/8 da glândula está infiltrada em um ou vários focos; 2+: não mais do que 1/4 da glândula é infiltrada por linfócitos; 3+: 1/4-1/2 da glândula é infiltrada por linfócitos; 4+: mais de 1/2 da glândula é destruída.
      NOTA: Recomenda-se remover a cartilagem tireoide para manter toda a estrutura da tireoide de rato, que é muito pequena para remover da traqueia.
  3. Medição de TPOAb
    NOTA: Células do ovário de hamster chinês (CHO) expressando de forma estável TPO de camundongo foram estabelecidas em nosso laboratório. O cDNA de TPO de camundongo foi excisado por XbaI e NheI. Em seguida, o cDNA foi transferido para pcDNA5/FRT. Após a construção bem-sucedida do plasmídeo, este foi transfectado para as células CHO e selecionado com higromicina B (100 g/mL).
    1. Após a construção das células mTPO-CHO, diluir os soros de camundongos a partir da etapa 3.1.3 (1:50) e incubar com as células mTPO-CHO por 2 h. Após a incubação, excluir a coloração celular com iodeto de propídio (1 g/mL) e analisar a amostra por citometria de fluxo usando IgG de cabra anti-camundongo conjugada com isotiocianato de fluoresceína e purificada por afinidade. Rastrear populações unicelulares sobreviventes por canais FSC-A e SSC-A e selecionar células marcadas com FITC e PI das populações unicelulares21.
    2. Incluir o soro de camundongos BALB/c ou C57BL/6 não imunizados ligados a IgG como controle negativo. Incluir anticorpos monoclonais de camundongo contra TPO22 humano como controles positivos que reconhecem TPO23 de camundongo. Expresse dados de vinculação TPO como meios geométricos.
  4. Dosagem de TgAb
    NOTA: Use um kit ELISA para detectar tireoglobulina seguindo as instruções do fabricante.
    1. Diluir as amostras padrão no tubo de microcentrífuga de acordo com as instruções. Retire o kit da geladeira e mantenha-o em temperatura ambiente por 30 min.
    2. Defina os poços padrão, poços em branco e poços de teste. Poços em branco só recebem tampão, enquanto poços padrão recebem soluções padrão. Adicionar 10 μL de amostras nos poços de ensaio. Ao adicionar as amostras, tente não tocar nas paredes dos poços e agite a placa suavemente para mover as amostras para o fundo dos poços.
    3. Incluir soro de camundongos BALB/c imunizados com Tg, CFA e IFA24 como controle positivo e soro de NOD de 8 semanas de idade. Camundongos H-2h4 em água regular como controle negativo.
    4. Incubar as amostras em banho-maria a 37 °C durante 30 min. Diluir o tampão de lavagem com água destilada na proporção de 1:30. Em seguida, remova a película de vedação, agite o líquido dentro da placa enzimática e seque em papel absorvente e adicione 350 μL de tampão de lavagem por 30 s. Repita este procedimento cinco vezes e, em seguida, acaricie os poços secos.
    5. Adicionar 50 μL de reagente de marcação enzimática a cada poço, exceto os poços em branco, e incubar em banho-maria de 37° por 30 min. Retire a película de vedação, agite o líquido dentro da placa enzimática e seque em papel absorvente.
    6. Adicione 50 μL de revelador A a cada poço seguido de 50 μL de revelador B e agite suavemente os poços para misturar por 5 min. Adicionar 50 μL da solução de terminação em cada poço durante 15 minutos para parar a reacção. Meça a absorbância (OD) de cada poço em um comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas. Apresentar os dados de TgAb como a densidade óptica (DO) a 490 nm.
  5. Dosagem de T4 e hormônio estimulante da tireoide (TSH)
    NOTA: Medir os níveis de T4 e TSH (em alíquotas de 10 μL) por ELISA seguindo as instruções do fabricante.
    1. Diluir o conjugado enzimático a 1:11 com o diluente de ensaio; diluir as amostras a medir (1:100) utilizando PBS 0,01 M.
    2. Adicionar 10 μL do padrão e da amostra aos poços correspondentes, adicionar 100 μL de conjugado enzimático a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
    3. Descarte o líquido nos poços e limpe-o com tampão de lavagem três vezes.
    4. Adicionar 100 μL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Adicionar 50 μL de solução stop e misturar suavemente durante 15-20 s.
    6. Determinar a absorbância (OD) utilizando um leitor de microplacas a um comprimento de onda de 450 nm e calcular a concentração da amostra.
    7. Use software estatístico para realizar o teste t ou teste de soma de postos e plotar os resultados.

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Resultados

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As alterações histológicas foram marcadamente diferentes em mulheres e homens, a duração da ingestão de iodo e a solução de NaI. Como mostrado na Figura 1, ~10% de NOD. Camundongos H-2h4 desenvolveram TSA mesmo sem indução de iodo com 24 semanas de idade, e todos os camundongos eventualmente desenvolveram tireoidite. Quando administrado água regular, não houve diferença significativa nas alterações histológicas entre machos e fêmeas. A adição de NaI à água potável acelerou o desenvolvimento ...

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Discussão

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A TH ocorre devido a uma desordem do sistema autoimune causada por linfócitos infiltrando a glândula tireoide, prejudicando ainda mais a função tireoidiana, enquanto produz anticorpos específicos da tireoide. Os níveis séricos de TSH, TgAb e TPOAb em pacientes com TH estão significativamente elevados27. Atualmente, dois tipos principais de modelos murinos são amplamente utilizados para estudar a etiologia da tireoidite autoimune: EAT e SAT29. Os camundongos EAT são principa...

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Divulgações

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Todos os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Anticorpos monoclonais de camundongo contra TPO humano (usados como controles positivos) foram fornecidos pelo Dr. P. Carayon e Dr. J. Ruf (Marselha, França). Os autores agradecem a todos os participantes deste estudo e aos membros de nossa equipe de pesquisa. Este trabalho foi parcialmente apoiado por subsídios do Fundo de Sustentação de Pós-doutorado do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan, China (2020HXBH057) e do Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (Projeto No. 2021YFS0166)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tartarato de butorfanolSupelcoL-044
Cloridrato de dexmedetomidina Sigma-Aldrich145108-58-3
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) bemSigma-AldrichM9410-1CS
Etanolmacklin64-17-5 
Freund' s Adjuvante, Completo Sigma-AldrichF5881 
Freund' s Adjuvante, Incompleto Sigma-AldrichF5506
IgG anti-rato para cabras invitrogenSA5-10275;
Solução de midazolam SupelcoM-908 
Tiroxina de camundongo/rato (T4) ELISACalbiotechDKO045
Paraformaldeídomacklin30525-89-4 
Iodeto de propídioSigma-AldrichP4864
Iodo de sódioSigma-Aldrich 7681-82-5
TireoglobulinaSigma-Aldrich T1126
Tireoglobulina  Kit ELISAThermo ScientificEHTGX5
TSH ELISACalbiotechDKO200
Xilenomacklin1330-20-7

Referências

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

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